活性氧和鈣離子參與鎘誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡過程調(diào)節(jié)

文/劉慧

鎘可使釀酒酵母細(xì)胞活性下降，誘發(fā)細(xì)胞死亡 // 以釀酒酵母為實(shí)驗(yàn)材料，研究了鎘（以CdCl2形式添加）對(duì)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。結(jié)果顯示，濃度為0.25～5 mmol/L的鎘可降低酵母細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；隨著鎘濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞死亡率增高。凋亡抑制劑Z-Asp-CH2-DCB與鎘共同作用后，細(xì)胞死亡率明顯低于鎘單獨(dú)處理組。經(jīng)鎘處理后，酵母細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平顯著升高；外源抗氧化劑抗壞血酸和過氧化氫酶能降低鎘引發(fā)的細(xì)胞死亡，特異性Ca2+螯合劑EGTA或Ca2+通道特異性抑制劑LaCl3亦可明顯降低鎘誘發(fā)的細(xì)胞死亡率。研究表明，鎘誘發(fā)的釀酒酵母細(xì)胞死亡過程存在依賴于caspase途徑的細(xì)胞凋亡途徑；鎘誘發(fā)的死亡與鎘處理組胞內(nèi)ROS和Ca2+水平升高有關(guān)，ROS可能通過增加胞內(nèi)Ca2+水平，繼而激活相關(guān)下游信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

鎘（Cd）是環(huán)境中常見的對(duì)人體毒性很強(qiáng)的重金屬污染物，工業(yè)生產(chǎn)、汽車尾氣排放、含鎘污水排放及土壤積累等均可導(dǎo)致大氣、水體和土壤的鎘污染。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的鎘可通過被污染的食物、飲水和粉塵等進(jìn)入人體，引發(fā)人肺組織、肝臟、腎、心血管、泌尿生殖系統(tǒng)、骨骼等的損傷，且鎘蓄積還可致癌。調(diào)查顯示，人體長(zhǎng)期接觸鎘會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)蛋白分子巰基和氨基與鎘結(jié)合，影響細(xì)胞內(nèi)正常鈣代謝和基因表達(dá)。研究表明，鎘暴露能影響細(xì)胞的增殖、分化、DNA復(fù)制和修復(fù)，可致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)代謝紊亂、生殖細(xì)胞畸形，并可產(chǎn)生致死作用。目前，關(guān)于鎘毒性作用的研究多數(shù)集中于氧化損傷方面。鎘暴露可引起胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平增高，由此可引發(fā)膜脂、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的氧化損傷，或激活細(xì)胞凋亡途徑。ROS和Ca2+在引發(fā)動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞死亡過程中具有重要的信號(hào)分子作用，但胞內(nèi)ROS和Ca2+是否在鎘誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞毒性中起作用及如何參與介導(dǎo)鎘誘導(dǎo)的毒性尚不明確。

目前，酵母細(xì)胞已作為細(xì)胞毒性作用研究的模式生物，對(duì)其細(xì)胞凋亡誘因、核心分子、傳導(dǎo)通路等均有了較深的了解。因此，本文以釀酒酵母細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，研究鎘對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)，以期為揭示鎘毒性作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

材料與方法

1.材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EGY48菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室；

YPD培養(yǎng)基：酵母粉1% ，蛋白胨2%，葡萄糖2%，pH值自然；

固體培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂。

2.菌株培養(yǎng)與藥物處理

■菌株培養(yǎng)

挑取酵母菌單菌落至 YPD 液體培養(yǎng)基中活化過夜。取適量活化菌液至YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)12～15 h后用于實(shí)驗(yàn)。

■藥物處理

離心收集細(xì)胞，用濃度為0.25～5 mmol/l的 CdCl2制成細(xì)胞懸液（細(xì)胞終濃度106 cell/mL），于30 ℃、200 r/min條件下孵育。

干預(yù)組分別采用0.5 mmol/L的泛Caspase抑制劑(Z-Asp-CH2-DCB)、0.5 mmol/L的抗壞血酸（AsA）、0.5 mmol/L的過氧化氫酶（CAT）、0.5 mmol/L的乙二醇雙四乙酸（EGTA）和0.5 mmol/L的LaCl3與CdCl2同時(shí)作用。

■細(xì)胞死亡率測(cè)定

采用美蘭染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率，具體操作為：藥物處理一定時(shí)間后，進(jìn)行細(xì)胞染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)著色細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞死亡率（死亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。每個(gè)處理觀察至少1000個(gè)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

■胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

收集5 mmol/L CdCl2處理6 h的酵母細(xì)胞及同期無鎘對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗滌并懸浮后加入終濃度為5 μmol/l的二氯熒光黃雙乙酸酯（DCFH-DA），30℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平。每個(gè)樣品測(cè)量50000個(gè)細(xì)胞，數(shù)據(jù)采集用CellQuest(3.1f)軟件，數(shù)據(jù)分析用ModFitLT(3.0)軟件。其中，橫坐標(biāo)代表平均熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)。

3.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析，用Duncan方法比較鎘處理組與對(duì)照組間的差異顯著性（*表示差異顯著，p＜0.05；**表示差異極顯著，p＜0.01）及干預(yù)組與處理組間的差異顯著性（&表示差異顯著，p＜0.05；&&表示差異極顯著，p＜0.01）。

結(jié)果

1.鎘處理對(duì)酵母細(xì)胞活性的影響

經(jīng)美藍(lán)染色后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組有個(gè)別細(xì)胞呈淡藍(lán)色，而鎘處理組中有較多細(xì)胞被染成藍(lán)色，說明鎘可降低酵母細(xì)胞活性，引發(fā)細(xì)胞死亡。從圖1可看出，經(jīng)0.05 mmol/L鎘處理后，細(xì)胞活性無明顯變化；濃度大于0.25 mmol/L的鎘處理組的細(xì)胞死亡率顯著高于對(duì)照，并隨鎘處理濃度的提高而增大；不同濃度鎘處理組的細(xì)胞死亡率均隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；5 mmol/L 鎘處理24 h后，細(xì)胞死亡率達(dá)到約60%。該結(jié)果表明，鎘對(duì)酵母細(xì)胞的毒性隨著鎘濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

圖1 鎘降低酵母細(xì)胞活性

圖2 泛caspase抑制劑對(duì)鎘誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡的影響

2.泛Caspase抑制劑對(duì)鎘毒性的干預(yù)作用

由圖2可知，鎘處理液中加入泛caspase抑制劑Z-Asp-CH2-DCB后，酵母細(xì)胞死亡率降低。用0.5 mmol/L的Z-Asp-CH2-DCB與0.5 mmol/L或5 mmol/L鎘共同作用6 h后，細(xì)胞死亡率顯著低于鎘單獨(dú)處理組（p＜0.05）；作用時(shí)間延至24 h時(shí)，鎘處理組與干預(yù)組的差異增大（p＜0.01）。該結(jié)果表明，泛Caspase抑制劑Z-Asp-CH2-DCB能顯著降低鎘引發(fā)的酵母細(xì)胞死亡，說明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中有類Caspase蛋白酶的參與。

3.ROS參與鎘誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)酵母細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L鎘處理6 h后胞內(nèi)ROS水平顯著增高，如圖3所示，約為對(duì)照組的6倍（p＜0.01）。為證實(shí)ROS升高在鎘毒性中的關(guān)系，本文在鎘處理液中加入一定量的外源抗氧化劑AsA和CAT降低胞內(nèi)ROS水平后檢測(cè)細(xì)胞死亡率，發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L的AsA與0.5 mmol/L或5 mmol/L的鎘共同處理后，細(xì)胞死亡率降低，如圖4所示，存活率提高，并與鎘單獨(dú)處理組產(chǎn)生顯著差異（P＜0.01）； 用 500 U 的 CAT與0.5 mmol/L或5 mmol/L的鎘共同處理后，細(xì)胞死亡率亦顯著低于同濃度鎘單獨(dú)處理組。上述結(jié)果說明鎘處理組胞內(nèi)ROS水平升高與鎘對(duì)酵母細(xì)胞的毒作用相關(guān)。

4.Ca2+參與鎘誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡

圖5 EGTA和LaCl3對(duì)鎘誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡的抑制作用

在鎘處理液中加入Ca2+特異性螯合劑EGTA或Ca2+通道特異性抑制劑LaCl3后，鎘誘發(fā)的細(xì)胞死亡率顯著下降，如圖5所示。用0.5 mmol/L的EGTA或LaCl3與0.5 mmol/L或5 mmol/L的鎘共同處理后，酵母細(xì)胞死亡率顯著低于鎘單獨(dú)處理組，說明鎘誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡過程與鎘處理組胞內(nèi)Ca2+水平的升高有關(guān)。加入質(zhì)膜Ca2+通道特異性抑制劑LaCl3后鎘毒性明顯降低，說明胞外Ca2+內(nèi)流在處理組胞內(nèi)Ca2+升高中發(fā)揮了重要作用。

討論

鎘是一種極其重要的工業(yè)和環(huán)境化學(xué)污染物，在生物體內(nèi)可與蛋白分子的氨基和巰基結(jié)合，使許多酶系統(tǒng)受到抑制，進(jìn)而影響生物體的正常生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘能誘導(dǎo)酵母細(xì)胞活性下降，甚至死亡。細(xì)胞凋亡的標(biāo)志是caspase的激活，有研究證明， caspase 抑制劑Z-Asp-CH2-DCB、TLCK、TPCK等可抑制脅迫引發(fā)的細(xì)胞死亡。本文采用泛caspase蛋白酶抑制劑后顯著提高了釀酒酵母菌株EGY48鎘處理組細(xì)胞的活性，與Nargund等在釀酒酵母BY4741菌株中的研究結(jié)果一致，說明鎘誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡過程中有類caspase蛋白酶的參與。

非生物脅迫引發(fā)胞內(nèi)ROS水平升高可以啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，也可引發(fā)生物大分子氧化損傷，使細(xì)胞代謝功能紊亂甚至死亡。研究表明，鎘可導(dǎo)致人、動(dòng)物和植物細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，外源性給予ROS清除劑可降低鎘暴露對(duì)細(xì)胞的毒作用。本研究在檢測(cè)到鎘對(duì)酵母細(xì)胞的毒作用后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)了鎘處理組酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平的顯著升高，將胞內(nèi)ROS升高與鎘毒性關(guān)聯(lián)；之后，用外源ROS清除劑AsA或CAT降低鎘處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平后檢測(cè)細(xì)胞死亡率，證實(shí)胞內(nèi)ROS水平降低后細(xì)胞死亡率下降，從而說明鎘毒性與胞內(nèi)ROS水平呈正相關(guān)，鎘引起ROS水平升高導(dǎo)致毒作用，胞內(nèi)ROS升高是誘發(fā)細(xì)胞死亡的重要原因。

Pei等的研究表明，ROS能激活質(zhì)膜Ca2+通道，引起胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+水平升高；而Ca2+失衡可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)、能量代謝等發(fā)生改變，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。Ca2+特異性螯合劑EGTA能通過螯合作用降低細(xì)胞外Ca2+濃度從而有效阻止胞外Ca2+內(nèi)流；LaCl3作為鈣離子通道特異性抑制劑，能有效阻止胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞。在本文中，加入EGTA或LaCl3后，能有效地阻止鎘誘發(fā)的酵母細(xì)胞死亡，即胞內(nèi)Ca2+下降可緩解鎘對(duì)酵母細(xì)胞的毒性，說明胞內(nèi)Ca2+的升高介導(dǎo)了鎘的毒作用，而胞外Ca2+內(nèi)流是胞內(nèi)Ca2+升高的重要原因。所以，鎘染毒誘發(fā)的酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高可能是通過激活質(zhì)膜Ca2+通道，使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平升高，從而激活相關(guān)下游信號(hào)，引發(fā)酵母細(xì)胞的死亡。

酵母細(xì)胞對(duì)環(huán)境毒物具有靈敏快速的反應(yīng)，有人用酵母細(xì)胞研究了鋁和砷的毒性效應(yīng)，揭示了其毒性作用的分子機(jī)制，表明酵母細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞的凋亡過程有高度的保守性。本文結(jié)果與前人利用人和動(dòng)物離體細(xì)胞研究鎘細(xì)胞毒性中發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)ROS和Ca2+水平升高的結(jié)果相似，說明鎘毒性在動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞中具有較高的一致性。而酵母細(xì)胞具有生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、遺傳背景簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可望作為研究環(huán)境化學(xué)物毒性作用的模式系統(tǒng)。

結(jié)論

濃度為0.25～5 mmol/L的鎘可使釀酒酵母細(xì)胞活性下降，誘發(fā)細(xì)胞死亡。鎘脅迫可致酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，過量的ROS可能會(huì)激活質(zhì)膜Ca2+通道，導(dǎo)致胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+水平升高，從而引發(fā)casase介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡。