忍冬葉高效液相指紋圖譜研究

馬子力，黃興龍，馮劍英，姚元貴，劉春艷，張 衛(wèi)，胡欣悅，張麗艷*，馬四補(bǔ)*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.赤水市人民醫(yī)院，貴州 赤水 564700)

忍冬葉為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥葉，是傳統(tǒng)中藥金銀花基源植物的葉[1]，該藥材分布于中國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)，如山東、河南、貴州、云南、山西、河北等地[2]。金銀花應(yīng)用歷史悠久，因其性甘寒氣芳香，清熱而不傷胃，芳香透達(dá)可祛外邪，自古就被稱為清熱解毒的良藥[3]，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、保肝利膽、抗病毒等多種藥理作用[4]。由于金銀花清熱解毒效果顯著，已被列為抗病毒的常用藥[5]，其市場(chǎng)需求量大，價(jià)格居高不下，亟需新的藥材替代品。目前《中國(guó)藥典》中僅收錄了金銀花、忍冬藤，還未對(duì)忍冬葉進(jìn)行深入研究，筆者通過查閱大量醫(yī)學(xué)典籍發(fā)現(xiàn)，忍冬葉的應(yīng)用歷史同樣悠久，在晉代《肘后備急方》中有“忍冬莖葉挫數(shù)壺煮”[6]的描述，表明莖葉同樣是該藥材的藥用部位。忍冬在生長(zhǎng)階段，忍冬葉的產(chǎn)量高于花的10倍左右[7]，但忍冬葉多數(shù)情況下未作為藥用部位而被遺棄[8]。臨床研究表明，使用鮮忍冬葉泡茶，急性腸炎患者可以在3天內(nèi)被治愈[9]。張寧等[10-12]通過研究發(fā)現(xiàn)，忍冬葉粗提物具有良好的抑菌、抗氧化等活性忍冬葉片因具有較高的產(chǎn)量，黃酮、綠原酸等多酚類物質(zhì)含量豐富，抗氧化、抑菌等藥理作用較明顯，目前已廣泛應(yīng)用于各種中成藥及飲品中[13-16]。鑒于忍冬葉的廣泛應(yīng)用，迫切需要建立忍冬葉HPLC指紋圖譜科學(xué)全面反映忍冬葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[17]，同時(shí)可為黔產(chǎn)忍冬葉載入地方標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；METTLER TOLEDO XSE105DU型十萬分之一電子分析天平(梅特勒公司)；FA1104型電子分析天平(上海方瑞公司)；US-1.3D型超聲波清洗器(中科儀儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇(色譜純，天津四友公司)；乙腈(色譜純，天津四友公司)；甲醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)；磷酸(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；木犀草苷對(duì)照品(供含量測(cè)定11720-201609，純度≥98%)、綠原酸對(duì)照品(供含量測(cè)定110753-201415)均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

樣品于2017年采自貴州省各區(qū)縣，陰干。藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThund.的干燥葉。藥材信息見表1。

表1 藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：以乙腈-0.5%甲酸梯度洗脫(見表2)；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。分別吸取溶液和供試品溶液各 10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，在擬訂色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相應(yīng)的色譜峰，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器純度測(cè)試，二者一致，各色譜峰均達(dá)到了基線分離。

表2 梯度洗脫條件

2.2 供試品及對(duì)照品溶液制備

樣品溶液制備：精密稱定藥材粉末(過四號(hào)篩)1 g于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，稱定重量，超聲60 min再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，精密量取20 mL樣品溶液揮發(fā)至干，再用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品15.26 mg、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品10.41 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，精密加入80%甲醇，定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取忍冬葉藥材(P1)1 g，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣測(cè)定。以綠原酸為參照峰，對(duì)特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，在特征圖譜中，各共有峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取忍冬葉藥材(P1)1 g，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特征圖譜中各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。以綠原酸為參照峰，計(jì)算特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，在特征圖譜中，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取忍冬葉藥材(P1)1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，于0、3、5、9、15、20 h內(nèi)測(cè)定同一供試品溶液，記錄特征圖譜中各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。以綠原酸為參照峰，計(jì)算特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，在特征圖譜中，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于5%，表明供試品溶液20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜共有指紋峰標(biāo)定

根據(jù)特征圖譜中10批樣品的測(cè)定結(jié)果，運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012A版軟件進(jìn)行分析。確定了指紋圖譜16個(gè)共有峰(圖1)。綠原酸是忍冬葉中的主要有效成分之一，因此，以3號(hào)峰(綠原酸)為參照峰，將“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，再與特征圖譜進(jìn)行保留時(shí)間的對(duì)比分析，最終指認(rèn)了3號(hào)峰為綠原酸、10號(hào)峰為木犀草苷(圖2)。各峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積結(jié)果如下(表3、表4)。

圖1 10批忍冬葉特征圖譜共有峰模式色譜

圖2 特征圖譜共有峰指認(rèn)色譜(綠原酸、木犀草苷)

表3 10批次忍冬葉相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批樣品共有峰相對(duì)峰面積

2.5 指紋圖譜相似度檢驗(yàn)

運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012.A版，采用中位數(shù)法計(jì)算10批樣品成分指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示，10批樣品的相似度和對(duì)照指紋圖譜(R)相似度均在0.9以上，表明樣品整體之間的相似度較高，結(jié)果如下表5。

表5 10批忍冬葉樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

注：S1～S10分別對(duì)應(yīng)藥材批號(hào)P1～P10；R為對(duì)照指紋圖譜。

3 討論

本研究前期考察了水浴回流、超聲等提取方法、80%甲醇、80%乙醇等提取溶劑及超聲提取時(shí)間進(jìn)行考察，得到80%甲醇，超聲提取60 min所呈現(xiàn)的色譜峰信息較豐富，且各峰的分離度較好。此外本研究同時(shí)對(duì)液相色譜條件進(jìn)行考察，通過考察乙腈-0.5%甲酸、乙腈-0.5%冰醋酸、乙腈-0.5%磷酸等三種流動(dòng)相，其結(jié)果顯示，乙腈-0.5%甲酸、乙腈-0.5%冰醋酸所呈現(xiàn)出的色譜峰信息較豐富，且分離度較好，但乙腈-0.5%甲酸所呈現(xiàn)出峰形較好，故最終選擇乙腈-0.5%甲酸作為流動(dòng)相。最后在其他色譜條件固定的條件下，對(duì)特征圖譜的柱溫(30 ℃、35 ℃、40 ℃)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示：在不同的柱溫下，除了各色譜峰的保留時(shí)間和分離度有差異以外，其峰面積無明顯區(qū)別，而35 ℃情況下各色譜峰分離度較好，故選擇柱溫為35 ℃。

綜上所述，本研究采用HPLC-DAD法，建立了10批忍冬葉指紋圖譜檢測(cè)方法，通過供試品溶液制備方法及色譜條件的考察，且對(duì)比不同波長(zhǎng)下色譜峰的出峰情況及分離度，最終建立了忍冬葉的特征圖譜，并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果該方法精密性、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，表明該方法穩(wěn)定可靠。以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012.A版軟件對(duì)不同產(chǎn)地的10個(gè)批次的樣品進(jìn)行分析，確定了忍冬葉成分共16個(gè)共有峰，并且用對(duì)照品指認(rèn)了2個(gè)共有峰，確定3號(hào)峰為綠原酸、10號(hào)峰為木犀草苷。綠原酸、木犀草苷為忍冬葉的主要指標(biāo)成分，且出峰時(shí)間較穩(wěn)定，分離度較好。從忍冬葉指紋圖譜相似度結(jié)果分析，10批忍冬葉指紋圖譜的相似度大于0.9，指紋圖譜全貌基本一致，說明不同批次忍冬葉化學(xué)組成一致，可為忍冬葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及該藥材質(zhì)量的客觀評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。