炒王不留行爆花與僵子差異性研究

林偉雄，魏 梅，鄧?yán)罴t，張志鵬，羅宇琴，魯 云

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

王不留行是石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟種子，為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]，具有活血通經(jīng)、下乳消腫、利尿通淋的功效；主要用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳汁不下、淋癥澀痛等癥[2]。研究顯示，王不留行主要化學(xué)成分為黃酮苷、生物堿、環(huán)肽類、三萜皂苷類、揮發(fā)油等[3-4]，其中王不留行黃酮苷和刺桐堿是其主要有效成分，具有促進(jìn)乳汁分泌、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、增強(qiáng)免疫和抗肝損傷等藥理作用[5-7]。

王不留行由于種子質(zhì)地堅(jiān)硬，有效成分不易煎出，炒法是王不留行自明代開始一直沿用至今的炮制工藝，炒制后的炒王不留行質(zhì)地松泡利于有效成分煎出且走散力強(qiáng)，長(zhǎng)于活血通經(jīng)、下乳、通淋[8]。近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者對(duì)王不留行炮制前后的區(qū)別進(jìn)行了大量的研究，認(rèn)為炮制后能提高王不留行有效成分水溶出率[5]，但未見對(duì)王不留行炒制過(guò)程中未爆開白花的僵化現(xiàn)象進(jìn)行研究，受限于當(dāng)前生產(chǎn)炒藥技術(shù)與設(shè)備水平，大生產(chǎn)機(jī)炒僵化現(xiàn)象比較常見，僵子入藥對(duì)炒王不留行主要指標(biāo)成分含量和整體功效是否存在影響是個(gè)值得探討的話題，本實(shí)驗(yàn)對(duì)炒王不留行爆花和僵子飲片水溶性浸出物和主要指標(biāo)成分含量進(jìn)行測(cè)定和比較，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代先進(jìn)UPLC技術(shù)，建立王不留行炒制前后UPLC特征圖譜，快速全面比較炒王不留行爆花和僵子飲片的差異性，建立王不留行及其炮制品飲片的更高質(zhì)量控制方法，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)和保證臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(沃特世公司，Waters e2695)；Waters超高效液相色譜儀(沃特世公司，Waters H-class)；TUV檢測(cè)器(沃特世公司)；Empower工作站；ME204E型萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)；XP26型百萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Direct 8/16 system型超純水機(jī)(默克公司)；KQ5500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

王不留行黃酮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度>99.7%，批號(hào)：111853-201704)，刺桐堿對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，純度>98.0%，批號(hào)：wkq18012302)。液相用甲醇、乙腈(默克股份有限公司)為色譜級(jí)，水為超純水(默克股份有限公司，Mili-Q Direct)，其余試劑為分析純。

王不留行藥材信息詳見表1，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合《中國(guó)藥典》2015版一部“王不留行”項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定。選取其中全國(guó)主要產(chǎn)區(qū)河北省的3批王不留行藥材Y18、Y19、Y20，作為炒王不留行爆花和僵子研究用。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品炮制

取凈王不留行置炒藥機(jī)內(nèi)，按《中國(guó)藥典》2015版清炒法(通則0213)炒至大多數(shù)爆開白花，呈類球形爆花狀，表面白色，質(zhì)松脆，取出，晾涼，篩去灰屑，得“炒王不留行飲片”。根據(jù)是否爆開白花將其分為“爆花飲片”和“僵子飲片”。

表1 王不留行藥材來(lái)源

2.2 浸出物測(cè)定

分別稱取樣品約2 g，以水為溶劑，照《中國(guó)藥典》2015版浸出物測(cè)定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表6。

2.3 王不留行黃酮苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Thermo Acclaim C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.3%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，35% A；10～20 min，35%～40% A；20～35 min，40%～50% A)，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速0.7 mL·min-1，柱溫30 ℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 取王不留行黃酮苷對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含王不留行黃酮苷0.772 8 mg的儲(chǔ)備液，精密量取儲(chǔ)備液2 mL于10 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含154.556 μg的溶液，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3.4 方法學(xué)考察 (1)專屬性試驗(yàn)。精密吸取王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液、空白溶劑和“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

注：A.供試品溶液；B.王不留行黃酮苷對(duì)照品；C.空白溶劑

(2)線性關(guān)系及范圍。精密量取上述王不留行黃酮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液10.0、6.0、2.0、1.0、0.5、0.1 mL，分別置10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成7.728、38.639、77.278、154.556、463.667、772.778 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，得王不留行黃酮苷回歸方程為Y=8 859X+5 253.8(R2=0.999 9)，表明在濃度為7.728 ～772.778 μg·min-1的范圍內(nèi)王不留行黃酮苷濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 王不留行黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線考察

(3)精密度試驗(yàn)。精密吸取王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算王不留行黃酮苷峰面積的RSD值為0.45%，表明儀器精密度良好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算王不留行黃酮苷峰面積的RSD值為0.52%，表明供試品溶液中王不留行黃酮苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

(5)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批樣品6份，按“2.3.3”項(xiàng)下確定的供試品溶液制備方法，分別制備王不留行黃酮苷含量測(cè)定供試品溶液6份。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果王不留行黃酮苷含量的RSD值為0.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

(6)加樣回收率試驗(yàn)。取已測(cè)定含量的王不留行粉末約0.6 g，精密稱定，分別精密加入一定量的王不留行黃酮苷對(duì)照品，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液9份。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算王不留行黃酮苷加樣回收率，結(jié)果見表3，平均回收率為99.42%，RSD值為1.35%，表明回收率良好。

表3 王不留行中王不留行黃酮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.3.5 樣品測(cè)定 將3批實(shí)驗(yàn)用生品、爆花和僵子飲片分別按照“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備相應(yīng)的供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算炮制后爆花和僵子飲片王不留行黃酮苷含量損失情況。結(jié)果見表6。

2.4 刺桐堿含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 YMC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～5.5 min，10%～15% A；5.5～11 min，15%～30% A；11～16.5 min，30%～70% A；16.5～16.51 min，70%～10% A；16.51～23 min，10% A)，檢測(cè)波長(zhǎng)219 nm，進(jìn)樣量1 μL，流速0.35 mL·min-1，柱溫35 ℃。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 取刺桐堿對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含刺桐堿0.160 9 mg的儲(chǔ)備液，精密量取儲(chǔ)備液2.5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含40.229 μg的溶液，搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 方法學(xué)考察 (1)專屬性考察。精密吸取刺桐堿對(duì)照品溶液、空白溶劑和“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

(2)線性關(guān)系考察。精密量取上述刺桐堿對(duì)照品儲(chǔ)備液10.0、5.0、2.5、2.0、1.0、0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成8.046、16.092、32.183、40.229、81.458、160.916 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定；以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，得刺桐堿的回歸方程為Y=19 677X-21 603(R2=0.999 7)，表明在濃度為8.046～160.916 μg·min-1范圍內(nèi)刺桐堿濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

表4 刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)曲線考察

注：A.供試品溶液；B.刺桐堿對(duì)照品；C.空白溶劑

(3)精密度試驗(yàn)。精密吸取刺桐堿對(duì)照品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算刺桐堿峰面積的RSD值為0.62%，表明儀器精密度良好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算刺桐堿峰面積的RSD值為1.11%，表明供試品溶液中刺桐堿在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

(5)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批樣品6份，按“2.4.3”項(xiàng)下確定的供試品溶液制備方法，分別制備刺桐堿含量測(cè)定供試品溶液6份。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果刺桐堿的含量RSD值為1.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

(6)加樣回收率試驗(yàn)。取已測(cè)定含量的王不留行粉末約0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的刺桐堿對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液9份。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算刺桐堿加樣回收率，結(jié)果見表5，平均回收率為96.68%，RSD值為2.40%，表明回收率良好。

表5 王不留行中刺桐堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.4.5 樣品測(cè)定 將3批實(shí)驗(yàn)用生品、爆花和僵子飲片分別按照“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備相應(yīng)的供試品溶液，并按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算炮制后爆花和僵子飲片刺桐堿含量損失情況。結(jié)果見表6。

表6 王不留行炮制前后變化情況 (%)

注：提高溶出率%=(飲片浸出物均值-生品浸出物均值)/生品浸出物均值×100%；損失率%=(1-飲片含量均值/生品含量均值)×100%。

浸出物結(jié)果顯示，炒制后飲片均能明顯增大生品的水溶性浸出物，爆花飲片能提高生品約70%的水溶出率，這也驗(yàn)證了前人研究結(jié)論[5]，而僵子飲片只能提高生品約30%水溶出率，炒制僵化現(xiàn)象會(huì)降低合格炒王不留行爆花飲片的水溶出率。王不留行生品、炒制后爆花和僵子飲片的王不留行黃酮苷含量均值分別為0.535%、0.265%、0.357%，刺桐堿含量均值分別為0.116%、0.082%、0.103%。炒制后主要指標(biāo)成分含量均出現(xiàn)明顯下降，炒制過(guò)程中含量不斷損失，爆花飲片中王不留行黃酮苷和刺桐堿含量分別損失50%和29%，而僵子飲片中相應(yīng)損失33%和11%，炒制后爆花飲片主要指標(biāo)成分損失率明顯大于僵子飲片。

2.5 特征圖譜測(cè)定

2.5.1 特征圖譜建立 取20個(gè)批次的王不留行藥材，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”條件測(cè)定并記錄色譜圖，分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件》(2012A)進(jìn)行比較分析，如圖3所示，共確定了5個(gè)共有特征峰，其中，與對(duì)照品對(duì)照指認(rèn)了峰1為刺桐堿，峰2為王不留行黃酮苷。以2號(hào)峰王不留行黃酮苷作為參照峰(S峰)，計(jì)算各共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，按照特征圖譜研究技術(shù)的要求，生成王不留行共有對(duì)照特征圖譜并建立王不留行UPLC特征圖譜，如圖4所示。

注：1.刺桐堿；2(S).王不留行黃酮苷

注：1.刺桐堿；2(S).王不留行黃酮苷

2.5.2 特征圖譜方法學(xué)考察 (1)精密度試驗(yàn)。同“2.4.3”項(xiàng)下測(cè)定，記錄色譜圖，以2號(hào)峰王不留行黃酮苷的色譜峰為參照峰，對(duì)各圖譜的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，其RSD值分別為0.00%～0.10%和0.00%～0.08%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜研究技術(shù)的要求。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)。同“2.4.3”項(xiàng)下(4)測(cè)定，記錄色譜圖，以2號(hào)峰王不留行黃酮苷的色譜峰為參照峰，對(duì)各圖譜的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，其RSD值分別為0.00%～0.33%和0.00%～0.52%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合特征圖譜研究技術(shù)的要求。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)。同“2.4.3”項(xiàng)下(5)測(cè)定，記錄色譜圖，以2號(hào)峰王不留行黃酮苷的色譜峰為參照峰，對(duì)各圖譜的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，其RSD值分別為0.00%～0.24%和0.00%～0.14%，表明該方法重復(fù)性良好，符合特征圖譜研究技術(shù)的要求。

2.5.3 特征圖譜檢測(cè)與分析 將3批實(shí)驗(yàn)用生品、爆花和僵子飲片分別按照“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”條件測(cè)定并記錄色譜圖，統(tǒng)計(jì)各共有峰特征峰保留時(shí)間和峰面積，見表7-表8，分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件》(2012A)進(jìn)行特征圖譜比較分析。如圖5所示，以峰2王不留行黃酮苷作為參照峰，計(jì)算各共有峰特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見表9-表10；并計(jì)算各樣品與20批王不留行藥材生成的共有對(duì)照特征圖譜間相似度，見表11；同時(shí)，將王不留行生品、爆花和僵子飲片分別生成共有對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行直觀比較，如圖6所示。

表7 共有特征峰保留時(shí)間 (min)

表8 共有特征峰峰面積

表9 共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間 (min)

表10 共有特征峰相對(duì)峰面積

表11 相似度計(jì)算結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，王不留行生品、炒制后爆花和僵子飲片各共有峰特征峰保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間較穩(wěn)定，而各共有峰特征峰的峰面積和相對(duì)峰面積發(fā)生了明顯變化。炒制后，峰1、2、4峰面積均明顯降低，且爆花飲片下降比僵子飲片明顯，而炒制后峰3峰面積明顯變大，但爆花和僵子飲片間差異性不大，均增大約2倍，峰5則基本不變，較為穩(wěn)定。

各樣品與20批王不留行藥材生成的共有對(duì)照特征圖譜間相似度均在0.90以上，相似度較高，表明炒制前后主要化學(xué)成分和色譜峰的數(shù)量基本一致，如圖6直觀可見，但爆花飲片與生成的共有對(duì)照特征圖譜間的相似度均低于僵子，表明炮制后爆花飲片各色譜峰變化程度大于僵子。

注：S1-S3為生品；B1-B3為爆花；J1-J3為僵子

注：A為生品；B為爆花；C為僵子

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炒制后飲片均能明顯增大生品的水溶性浸出物，但爆花飲片對(duì)生品的水溶出率提高能力約為僵子飲片的2倍；炒制后主要指標(biāo)成分含量均出現(xiàn)明顯下降，炒制過(guò)程中含量不斷損失，爆花飲片主要指標(biāo)成分損失量明顯大于僵子飲片，可能是僵化現(xiàn)象減少了指標(biāo)成分的破壞損失?！吨袊?guó)藥典》2015年版王不留行藥材含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定王不留行黃酮苷不得少于0.40%，炒王不留行飲片含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定王不留行黃酮苷不得少于0.15%，也說(shuō)明該成分炮制后是會(huì)明顯降低，但未對(duì)炮制品含量上限作出進(jìn)一步規(guī)定。受限于當(dāng)前生產(chǎn)炒藥技術(shù)和設(shè)備水平，機(jī)炒王不留行的爆花率偏低一直是中藥炮制的重難點(diǎn)之一，僵化現(xiàn)象較為常見，炒王不留行飲片中混有較多僵子，其王不留行黃酮苷的含量會(huì)明顯高于完全爆開白花飲片的含量，出現(xiàn)炮制品含量符合藥典要求，但實(shí)際飲片性狀不符合藥典要求的情況。特征圖譜結(jié)果顯示，炒制后爆花和僵子飲片峰1、2、4峰面積均明顯降低，且爆花飲片降低幅度均大于僵子飲片，爆花飲片與生品相似度較小，說(shuō)明兩者間差異性較大?？傮w來(lái)看，炮制合格爆花飲片從水溶性浸出物、主要指標(biāo)成分含量、特征圖譜總體情況等與生品間的差異性較大，這也是王不留行生品炮制可以明顯提高其活血通經(jīng)、下乳、通淋的作用其意義所在，而僵子與生品差異性較小，主要指標(biāo)成分含量雖然合格，但會(huì)影響炒王不留行合格飲片的水溶出率，降低炒王不留行水提過(guò)程有效成分的煎出，同時(shí)也影響特征圖譜中部分峰的變化，僵子飲片可能難以發(fā)揮炒制合格的爆花飲片長(zhǎng)于王不留行生品的功效，有待進(jìn)一步研究。

炮制作為中藥的精華和特色，對(duì)保證中藥臨床療效具有十分重要的作用。中醫(yī)醫(yī)師在臨證處方時(shí)，常根據(jù)不同病情選用不同炮制品，有目的地運(yùn)用以提高臨床療效。因此，炒王不留行不同爆花程度的飲片選擇和質(zhì)量控制對(duì)中醫(yī)臨床的安全性和有效性至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)建立了王不留行炮制前后UPLC特征圖譜，分離效果好，重復(fù)性強(qiáng)，保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，各共有特征峰含量變化明顯，且可同時(shí)測(cè)定刺桐堿含量，能簡(jiǎn)單快速全面地控制王不留行炮制前后特征信息，并結(jié)合《中國(guó)藥典》2015版“王不留行”項(xiàng)下王不留行黃酮苷含量測(cè)定方法，對(duì)王不留行炮制前后主要指標(biāo)成分刺桐堿和王不留行黃酮苷進(jìn)行雙指標(biāo)含量控制，更加全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)王不留行炮制前后及不同炒制程度爆花與僵子飲片的差異性，更好地保證飲片質(zhì)量和臨床療效。