PCPA失眠大鼠腦干NG2細胞和NMDA受體的表達及酸棗仁湯的干預(yù)作用

郭海波，全 睿，滕 柳，石 鵬，王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002)

睡眠與膠質(zhì)細胞關(guān)系密切[1]。NG2細胞作為新型膠質(zhì)細胞[2]，被認(rèn)為是一種動態(tài)的前體膠質(zhì)細胞群，它在體內(nèi)不斷分化和遷移，在大腦不同區(qū)域及不同發(fā)育時間廣泛存在。它與神經(jīng)元之間形成突觸聯(lián)系[3]，參與突觸可塑性和調(diào)節(jié)、支持、營養(yǎng)神經(jīng)元[4]，在神經(jīng)信息傳遞中起著重要作用。睡眠不足可以影響髓鞘形成相關(guān)基因的表達，而NG2細胞作為少突膠質(zhì)細胞前體細胞，也受到睡眠的調(diào)節(jié)和影響[5]。

對氯苯丙氨酸(P-chlorophenylalanine，PCPA)作為五羥色胺合成酶——色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)的拮抗劑，能夠阻斷腦內(nèi)五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)合成，減少腦內(nèi)5-HT含量，使動物出現(xiàn)失眠。利用PCPA建立失眠動物模型，因效果確切、操作方便受到諸多學(xué)者的青睞[6]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是興奮性氨基酸——谷氨酸(Glutamate，Glu)的離子型受體，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)表達廣泛，調(diào)控突觸可塑性和神經(jīng)元長時程增強效應(yīng)[7]，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，對生物發(fā)育過程極為重要[8]。在神經(jīng)退行性疾病、腦缺血等發(fā)生機制中也起到重要作用[9]。有研究顯示NMDA受體功能低下可導(dǎo)致小鼠睡眠-覺醒障礙，晝夜節(jié)律延長，入睡延遲[10]；還有研究顯示，睡眠剝奪可導(dǎo)致腦扣帶回前部NMDA受體亞基表達水平顯著上調(diào)[11]。酸棗仁湯(Suanzaoren Decoction，SZRD)是中國漢代著名醫(yī)家張仲景的經(jīng)典方劑，現(xiàn)代研究顯示酸棗仁湯治療失眠的機制與調(diào)控腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平和抑制膠質(zhì)細胞激活有關(guān)[12]，但酸棗仁湯干預(yù)失眠的機制是否與NG2細胞和NMDA受體相關(guān)，目前尚不清楚。本研究探討PCPA導(dǎo)致的失眠經(jīng)酸棗仁湯治療后腦干NG2細胞和NMDA受體表達的變化，旨在進一步揭示酸棗仁湯治療失眠的可能機制。

1 材料與試劑

1.1 動物

健康SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠50只，體重(200±20)g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號NO.SCXK(湘)2014-0011。在安靜、自然光、溫度保持恒定(22±2)℃的環(huán)境中隨意獲取食物和水，飼養(yǎng)7天后進入實驗。飼養(yǎng)和實驗條件均符合貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理和實驗相關(guān)要求。

1.2 器材、試劑和藥物

7500實時熒光定量PCR擴增儀(美國ABI公司)；NP80超微量分光光度計(德國Implen公司)；PCPA(C-6506，Sigama公司)；中藥材(酸棗仁、知母、茯苓、川芎、炙甘草)購自北京同仁堂貴陽藥店。Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(賽默飛世爾科技有限公司)，qPCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 藥物制備

SZRD處方參照《方劑學(xué)》第5版教材：酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g組成。稱取以上五味藥材10劑共460 g，加8倍量水，浸泡1 h后煎煮1 h，沸后30 min紗布濾過。藥渣加6倍水煎煮，沸后20 min紗布濾過，合并兩次濾液，濃縮成150%濃度(含生藥量15 g/mL)的水提物，分裝滅菌，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆肹12]。

PCPA溶液制備：將PCPA按照350 mg/kg計算總用量，稱量PCPA粉末，倒進滅菌后的研缽內(nèi)，加少量生理鹽水研磨30 min，邊研磨邊加水，直至達到所需濃度。將PCPA懸浮液收集至試劑瓶，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

2.2 分組、給藥方法和造模

隨機分為5組：正常組、對照組、PCPA組、SZRD組、PCPA+SZRD組，每組10只。正常組不給任何處理；對照組腹腔注射生理鹽水；PCPA組和PCPA+SZRD組腹腔注射PCPA 350 mg/kg，SZRD組腹腔注射等體積的生理鹽水。腹腔注射均為每天1次連續(xù)6天。第7天開始，正常組不做處理，對照組和PCPA組灌胃生理鹽水，SZRD組和PCPA+SZRD組灌胃SZRD。酸棗仁湯灌胃按照7.5 g/kg以10 mL/kg體積，每天1次，連續(xù)8天。8天后取材進行RT-PCR檢測。腹腔注射PCPA 3天后可見大鼠晝夜節(jié)律消失，白天活動增加，皮毛無光澤及脫毛增加，體重增長緩慢，攻擊性增強等，整體觀察和對照組形成鮮明對比，表明失眠模型復(fù)制成功。

2.3 取材

大鼠在末次給藥2 h后腹腔注射苯巴比妥1.25 mg/kg麻醉后，于冰上快速取出腦組織，分離腦干，迅速將腦干置于4%多聚甲醛標(biāo)本瓶中，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物設(shè)計

應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計RT-PCR所需相關(guān)特異性引物，交由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表1。

表1 引物序列和片段大小

2.5 總RNA的提取，cDNA的合成和反應(yīng)條件

Trizol法提取總RNA，用NP80超微量分光光度計測定、計算RNA純度和濃度，A260/A280比值在1.8～2.0為純度合格，總RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)RNA濃度計算逆轉(zhuǎn)錄加入量，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆??？傮w積采用20μL反應(yīng)體系進行擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。試驗樣品每組做3個重復(fù)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

結(jié)果顯示(見表2)，與對照組比較，PCPA組NG2 mRNA的表達升高(P<0.05)，NMDA受體mRNA的表達顯著升高(P<0.01)，5-HT1A受體mRNA表達下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與PCPA組比較，PCPA+SZRD組NG2細胞、NMDA受體mRNA的表達下降(P<0.05)，5-HT1A受體mRNA的表達升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。正常組NG2、NMDA受體、5-HT1A受體表達量和對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

分組例數(shù)(n)NG2NMDAR5-HT1AR正常組100.946±0.1190.995±0.1051.614±0.337對照組100.995±0.1561.065±0.1591.715±0.279PCPA組101.315±0.051?1.638±0.081??1.230±0.135?SZRD組101.004±0.1301.277±0.1171.722±0.118PCPA+SZRD組101.107±0.023#1.362±0.154#1.627±0.109#

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。與PCPA組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

5-HT是腦內(nèi)最重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，與睡眠關(guān)系密切。PCPA通過拮抗色氨酸羥基化而阻斷和耗竭腦內(nèi)5-HT的合成[13]，進而導(dǎo)致失眠。本實驗采用腹腔注射PCPA成功制作大鼠失眠模型，觀察了SZRD對失眠大鼠腦干NG2、NMDA受體的表達，以及與睡眠最密切的5-HT受體亞型之一：5-HT1A受體的變化。結(jié)果顯示，腹腔注射PCPA后，失眠大鼠腦干NG2、NMDA表達升高，5-HT1A表達下降。SZRD治療后，NG2、NMDA受體表達下降，5-HT1A表達升高。而對照組與正常組無顯著差異，說明SZRD對正常大鼠腦干NG2、5-HT1A、NMDA受體無明顯作用。

目前所知，所有的動物都需要睡眠[14]，睡眠障礙可導(dǎo)致不良后果，其重要性無需多言，但睡眠對NG2細胞的影響目前知之甚少。NG2細胞被認(rèn)為是存在于CNS的第四個膠質(zhì)細胞群[2]，它與神經(jīng)元之間存在著經(jīng)典或非經(jīng)典的突觸聯(lián)系。腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的Glu能系統(tǒng)參與了覺醒的發(fā)生。在新生鼠和成年小鼠海馬切片中發(fā)現(xiàn)存在著神經(jīng)元-NG2細胞的Glu能突觸[15]。Glu在CNS中的作用主要是通過其受體介導(dǎo)。Glu受體分為兩類：離子型受體和代謝型受體。NMDA受體屬于離子型受體，主要作用是參與生理狀態(tài)下的突觸可塑性和病理狀態(tài)下的興奮性毒性[16]。NG2細胞可表達多種Glu受體，其中就包括NMDA受體[17]。研究顯示，NMDA受體與睡眠關(guān)系密切，它被阻滯后可影響睡眠[18]，而睡眠障礙也可以影響NMDA受體的表達[19]。NMDA還是5-HT1A、2A、2C受體的重要靶標(biāo)[20-21]，有研究顯示通過與NMDA相互作用，不同的5-HT受體亞型調(diào)節(jié)前額皮質(zhì)神經(jīng)元放電存在著差異，5-HT受體對興奮性的復(fù)雜效應(yīng)被選擇性改變[22]。5-HT和NMDA受體的信號傳導(dǎo)均參與了大腦的認(rèn)知和情緒的調(diào)節(jié)，這通常與焦慮、失眠和抑郁等精神障礙相關(guān)。大鼠腹腔注射PCPA導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT濃度下降以后腦干NG2和NMDA受體表達增加，極有可能與離子通道信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本課題組以往研究表明，PCPA導(dǎo)致的失眠可使大鼠大腦微透析液中的Glu含量升高[23]，Glu的大量升高會過度激活突觸后NMDA受體，使其表達增加，NMDA受體表達增加可導(dǎo)致離子通道開放，產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流，以此影響神經(jīng)細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與大腦認(rèn)知和情緒調(diào)節(jié)。NG2細胞可以通過所表達的受體對相關(guān)神經(jīng)信號作出反應(yīng)，進而參與睡眠剝奪的過程。但5-HT合成減少后NG2信號傳遞的機制仍需要進一步明確。

有研究顯示，NG2細胞不僅可以作為少突膠質(zhì)細胞前體細胞參與髓鞘的形成和損傷的修復(fù)[24]，同時與CNS損傷，如脫髓鞘、外傷、缺血和膠質(zhì)瘤形成等病理狀態(tài)密切相關(guān)[25]；但NG2細胞仍不同于少突膠質(zhì)細胞，二者對應(yīng)激反應(yīng)的基因表達有著明顯的區(qū)域特異性[26]。成人NG2細胞在機械損傷、興奮性毒性和病毒感染等其它CNS損傷后也可被激活和增殖[27]，神經(jīng)/膠質(zhì)抗原2(NG2)還是病理狀態(tài)下周圍細胞活化的早期標(biāo)志[28]，在神經(jīng)受損后，NG2細胞的增殖能力迅速增加并向組織損傷區(qū)域遷移[29]，作為關(guān)鍵成分在損傷神經(jīng)周圍形成高阻抗膠質(zhì)瘢痕，在神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮著積極作用。有研究顯示，睡眠不足可以抑制髓鞘形成相關(guān)基因的表達[30]，對NG2細胞的分化和增值有著不同影響[31-32]。PCPA導(dǎo)致睡眠剝奪后NG2細胞表達增加，可能還與NG2細胞對應(yīng)激的高度反應(yīng)性相關(guān)，因其功能之一就是響應(yīng)CNS的損傷在神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。

綜上所述，PCPA導(dǎo)致的失眠可引起大鼠腦干NG2細胞和NMDA受體表達增加，酸棗仁湯干預(yù)后，NG2細胞和NMDA受體表達下降，這有可能是酸棗仁湯治療失眠的靶點之一，從而進一步揭示了酸棗仁湯治療失眠的潛在機制。利用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對中藥復(fù)方的作用機制進行研究有助于我們深入、系統(tǒng)地了解中藥復(fù)方的藥效基礎(chǔ)和作用機理，可以有效促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化。