25種黔產(chǎn)中藥材提取物體外抑菌活性的篩選

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1. 安順學(xué)院附屬高級(jí)中學(xué)，貴州 安順 561000；2. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；3. 安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州 安順 561000；4. 重慶優(yōu)量健康管理有限公司,重慶 400000

大腸桿菌(Escherichia coli, EC)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)現(xiàn)已成為世界上醫(yī)院內(nèi)常見(jiàn)的致病菌，被列為世界范圍內(nèi)最難解決的感染病菌之一[1-2]。大腸桿菌是哺乳動(dòng)物小腸內(nèi)的共生菌且廣泛存在于生物體中。在人類(lèi)中，大腸桿菌對(duì)腸道的感染部位分為腸外和腸內(nèi)，主要通過(guò)被污染的食物經(jīng)攝食進(jìn)入體內(nèi)而致病，引起急性腹瀉、血壓驟降以及人體脫水，腸道外感染會(huì)引發(fā)器官化膿等[3]。金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，它可以使生物體內(nèi)的器官局部化膿感染，嚴(yán)重的會(huì)引起肺炎、心包炎、腸炎和敗血癥等[4]。

由于全世界范圍內(nèi)抗生素的不合理的應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性對(duì)人類(lèi)的危害變得越來(lái)越嚴(yán)重，人們把目標(biāo)投向了來(lái)源廣泛、安全性高、廉價(jià)易得、抗耐藥機(jī)制獨(dú)特的中藥材[5-6]。貴州是中國(guó)中藥資源大省，自古“黔地?zé)o閑草，夜郎多靈藥”，特定的氣候條件適宜多種藥用植物的生長(zhǎng)繁殖，且品質(zhì)優(yōu)良。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的體外抑菌作用，以期篩選出抗菌活性較強(qiáng)的黔產(chǎn)中藥材，在天然中藥材中找到解決耐藥性問(wèn)題的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 供試25種中藥材均購(gòu)于貴州省藥材總公司。25種黔產(chǎn)中藥材種名和科屬見(jiàn)表1[7]。大腸桿菌(Escherichiacoli, EC)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)由安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院提供。氫氧化鈉、氯化氫、氯化鈉、無(wú)水乙醇，均為分析純?cè)噭?購(gòu)自貴州博奧瑞杰生物科技有限公司)。SHP150型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，XD2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，SPDJ型凈化工作臺(tái)(上海浦東物理興學(xué)化學(xué)儀器廠)，LDZX50FB高壓滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)。

表1 25種黔產(chǎn)中藥材

1.2 藥材醇提物的制備 稱取30 g黔產(chǎn)中藥材，粉碎并過(guò)篩，以10倍體積(W/V)70%乙醇300 mL，回流提取兩次，每次1h，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用70%乙醇溶解定容至30 mL，4℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。注：100%藥液濃度定義為1 g中藥材濃縮至1 mL提取液的濃度。

1.3 培養(yǎng)基的配制 肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌20 min。肉湯瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl:5 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1000 mL，pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌20 min。

1.4 供試菌種的活化和菌懸液的制備 分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接入無(wú)菌斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，然后分別挑取活化好的1環(huán)菌種放入9 mL無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基中，震蕩搖勻。稀釋成濃度約為0.1×108CFU/mL的菌懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 抑菌環(huán)的測(cè)定 將已滅菌的肉湯瓊脂培養(yǎng)基倒入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿上(厚度為3 mm)，用無(wú)菌棉簽取濃度為0.1×108CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基。用無(wú)菌鑷子夾取浸透黔產(chǎn)中藥材提取物的紙錠(直徑為6 mm)放在含菌培養(yǎng)基表面，以無(wú)菌70%乙醇浸透的紙錠作對(duì)照，37℃培養(yǎng)24h，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 MIC的測(cè)定 采用倍比稀釋法，取9支試管，于每管中先加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2 mL，然后于第1支試管中加入藥液2 mL混勻后再取出2 mL混合液放入第2支試管中，混勻后取出2 mL加入第3支試管中，以此類(lèi)推，直到第9支試管混勻后棄掉2 mL，使得稀釋后各試管中的受試藥液濃度倍比降低，最后取0.1 mL菌懸液分別加入上述的試管中混勻，37℃培養(yǎng)24 h后觀察生長(zhǎng)情況，受試藥物重復(fù)3次。將透明的最低藥液濃度定為最低抑菌濃度。

1.7 MBC的測(cè)定 將最低抑菌濃度以上的各濃度培養(yǎng)物分別取0.1 mL加到無(wú)菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布棒將菌液涂勻，37℃培養(yǎng)24 h后觀察生長(zhǎng)情況，重復(fù)3次。將無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度定為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 25種黔產(chǎn)中藥材醇提物的抑菌圈直徑 通過(guò)紙錠瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定提取物的抑菌圈。由表2可知，25種黔產(chǎn)中藥材中黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚(yú)腥草、金錢(qián)草、夏枯草、厚樸、野菊花、川芎、金櫻子、五味子、白芨等15種黔產(chǎn)中藥材分別對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑菌效果。連錢(qián)草、仙鶴草、紫珠、草赤芍、地骨皮、白芍、麥門(mén)冬、雞矢藤等8種中藥材對(duì)兩種病原菌的抑菌效果均不明顯。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚(yú)腥草、金錢(qián)草5種中藥材均對(duì)兩種病原菌的抑菌圈d≥20 mm，表明其抑菌效果最好，如圖1所示。70%乙醇作為對(duì)照組抑菌圈不明顯，表明其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。

表2 25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)兩種菌種的抑菌圈

注：“-”表示沒(méi)有抑菌圈

A: 乙醇對(duì)照組(EC) B: 黃連醇提物(EC) C: 乙醇對(duì)照組(SA) D: 夏枯草醇提物(SA)圖1 黃連和夏枯草醇提物對(duì)兩種供試菌的抑菌圈直徑大小圖

2.2 25種黔產(chǎn)中藥材醇提物對(duì)兩種菌種的MIC 通過(guò)倍比稀釋法對(duì)25種黔產(chǎn)中藥材MIC測(cè)定。由表3可知，黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚(yú)腥草、金錢(qián)草、夏枯草、厚樸、野菊花、川芎、金櫻子、五味子、白芨、地榆等16種黔產(chǎn)中藥材對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC范圍在15.625 ～250 mg/mL之間。黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚(yú)腥草、金錢(qián)草、夏枯草、野菊花、厚樸、川穹、金櫻子、五味子、白芨、透骨草等16種黔產(chǎn)中藥材對(duì)大腸桿菌的MIC范圍在7.82 ～250 mg/mL之間。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚(yú)腥草、金錢(qián)草5種中藥材對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC在7.82 ～31.25 mg/mL之間，表明其抑菌效果最好。

表3 25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)兩種菌種的MIC測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3表3 25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)兩種菌種的MIC測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)；“+”表示有菌生長(zhǎng)。“+”個(gè)數(shù)不同表示渾濁度不同。

2.3 25種黔產(chǎn)中藥材醇提物對(duì)兩種菌種的MBC 由表4可知，黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚(yú)腥草、金錢(qián)草、夏枯草、厚樸、野菊花、川穹、金櫻子、五味子、白芨、地榆等16種黔產(chǎn)中藥材對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC范圍在31.25 ～1000 mg/mL之間。黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚(yú)腥草、金錢(qián)草、夏枯草、厚樸、野菊花、川芎、金櫻子、五味子、白芨、透骨草等16種黔產(chǎn)中藥材對(duì)大腸桿菌的MBC范圍在15.625 ～1000 mg/mL之間。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚(yú)腥草、金錢(qián)草5種中藥材對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MBC范圍在15.625 ～62.5 mg/mL之間，說(shuō)明其殺菌效果最好。

表4 25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)兩種菌種的MBC測(cè)定結(jié)果

續(xù)表4表4 25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)兩種菌種的MBC測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)；“+”表示有菌生長(zhǎng)；空白處表示藥液殺菌濃度過(guò)高或者該藥液沒(méi)有殺菌作用。

3 討論

本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)和醫(yī)學(xué)古籍，總結(jié)臨床醫(yī)學(xué)經(jīng)驗(yàn)[8-11]，采用體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了15種黔產(chǎn)中藥材分別對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑菌效果。其中，黃連、大黃、魚(yú)腥草、夏枯草、金錢(qián)草5種中藥材對(duì)這兩種病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)只研究了25種黔產(chǎn)中藥材對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，而現(xiàn)如今多種多樣的致病性病原菌越來(lái)越廣泛，致病菌耐藥性問(wèn)題較為嚴(yán)重，且傳染性疾病對(duì)社會(huì)恐慌影響較大。在后期的研究過(guò)程中，課題組將會(huì)繼續(xù)研究黔產(chǎn)中藥材對(duì)其它致病性病原菌的抑菌機(jī)理和抗耐藥性，希冀通過(guò)研發(fā)新型的“中藥綠色抗生素”，解決致病菌耐藥性問(wèn)題，有助于合理深入開(kāi)發(fā)利用貴州中藥資源。