菊芋查爾酮合成酶基因的克隆與表達(dá)分析

李文靜，孫艷香，付亞娟，蘇彥蘋，王聰艷，侯曉強(qiáng)，張新業(yè)

（1.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000；2.河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000；3.廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000）

類黃酮（又稱黃酮類化合物）是植物中廣泛存在的一類具有重要生物功能的次級(jí)代謝產(chǎn)物，種類繁多，且生理作用廣泛［1］。類黃酮合成通過苯丙醇和聚酮途徑，起始階段為1分子香豆酰輔酶A 和3分子丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）縮合形成柚皮素查爾酮（naringenin chalcone），該產(chǎn)物經(jīng)過多步酶促反應(yīng)生成類黃酮和花青素［2-4］。查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）屬于III型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS），是植物聚酮合酶超家族中最具代表性的一員，是黃酮／類黃酮合成過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶、限速酶。1983年首次從歐芹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中獲得CHS 基因的cDNA 序列，此后多種植物中的CHS 基因陸續(xù)被克?。?-6］。CHS參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，此外CHS基因在脅迫條件下能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，引起黃酮和植保素的聚集，從而參與水楊酸防御途徑［7］。不同物種的CHS 基因序列較為保守，多數(shù)基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子；內(nèi)含子存在位置相對(duì)保守，但其長(zhǎng)度在不同的物種間變化較大；第1外顯子通常編碼37～64個(gè)氨基酸殘基，第2外顯子大約編碼340個(gè)氨基酸殘基，且第2外顯子較第1外顯子具有更高的保守性，編碼了幾乎所有的活性位點(diǎn)［8］。

菊芋為菊科（Asteraceae）向日葵屬（Helianthus）多年生草本植物，原產(chǎn)于北美，17世紀(jì)傳入歐洲，由于其耐寒耐旱，適應(yīng)性強(qiáng)，現(xiàn)已引種到世界許多國(guó)家和地區(qū)［9-10］。由于菊芋對(duì)于改良鹽堿土地、修復(fù)油田污染土地以及煤礦開采方面具有重要作用，近年來在山西、黑龍江、山東、江蘇等省規(guī)模種植，且已經(jīng)取得顯著的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益［11］。菊芋用途廣泛，塊莖中含有豐富的糖分和菊粉，可供食用，地上部分莖稈可作動(dòng)物飼料［12］；菊芋在抗菌、調(diào)節(jié)腸道功能、抗腫瘤等方面也具有一定的藥用價(jià)值［13］；此外，菊芋還可作為生物燃料和造紙工業(yè)的原料［14-15］。菊芋中黃酮類物質(zhì)含量較豐富，尤其是在葉片中，這對(duì)于菊芋的抗氧化活性至關(guān)重要［16］。目前對(duì)菊芋的研究主要集中在品 種 選 育［17-19］、栽 培 引 種［20］、菊 糖 提 取 工 藝 優(yōu)化［21］及非生物脅迫等方面［22］，關(guān)于菊芋中類黃酮代謝途徑基因克隆鮮見報(bào)道。

鑒于CHS 在類黃酮合成途徑中的重要作用，本研究擬以菊芋為材料，根據(jù)同源克隆，獲得HtCHS 基因序列，設(shè)計(jì)引物分別對(duì)其DNA 和cDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過克隆、測(cè)序及比對(duì)，獲得其基因結(jié)構(gòu)；通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化地位；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析其組織表達(dá)部位和誘導(dǎo)表達(dá)情況；構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28acHtCHS并進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。該研究可為后續(xù)利用該基因調(diào)控菊芋黃酮類成分的生物合成，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的菊芋品種選育研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)采用的菊芋‘廊芋8號(hào)’種植于河北省廊坊市思科農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司育種基地，采集其根、莖、葉片及塊莖，液氮速凍，用于組織表達(dá)模式分析。取苗期菊芋，分別置于水、20%PEG 6000和150mmol·L-1NaCl中脅迫處理0、6、12、24 h，總計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取葉片液氮速凍，用于誘導(dǎo)表達(dá)分析。大腸桿菌（Escherichia coli T.Escherich）菌株Tran10 和BL21（DE3）購自北京全式金生物公司；pET-28a載體由植物分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、RNAprep pure試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒購自艾德萊公司；GoScriptTMReverse Transcription System 購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、卡那霉素、IPTG 均購自大連寶生物公司（TaKaRa）；Ligtaion high購自東洋紡公司；引物合成和基因測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 菊芋總RNA提取及cDNA 的合成

菊芋不同組織部位及不同處理材料總RNA提取采用RNAprep pure試劑盒，利用DNaseI去除基因組后，經(jīng)10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完 整 性、NanoDrop 2000c檢 測(cè)RNA 濃 度和純度；之后使用RNA 進(jìn)行第一鏈cDNA 合成，按 照GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒說明書進(jìn)行，―20 ℃保存，備用。

1.3 菊芋基因組DNA 提取

參照艾德萊CTAB植物基因組DNA 快速提取試劑盒說明書提取菊芋葉片DNA，利用RNase去除RNA 后，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c對(duì)DNA 完整性、濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 HtCHS 基因cDNA及gDNA序列的克隆

根據(jù)GenBank中收錄的向日葵、野菊花、甘菊、菜薊、紫背天葵菜CHS 基因序列及原核表達(dá)載體pET-28a多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)1對(duì)含有酶切位點(diǎn)引物CHS7peF 和CHS7peR（表1）。分別以cDNA 和gDNA 為 模 板 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增，反 應(yīng) 程序采用降落PCR（touch down PCR），95 ℃預(yù)變性5min；95 ℃變性30s，65～55 ℃退火30s（每個(gè)循環(huán)降1 ℃），72 ℃延伸50s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5min。10g／L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收目的片段，并連接pTOPO 平末端載體，經(jīng)酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pTOPO-BcHtCHS和pTOPO-B-gHtCHS，送測(cè)序。

1.5 HtCHS 基因結(jié)構(gòu)分析

將測(cè)序獲得的gDNA 和cDNA 序列提交https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，確定外顯子、內(nèi)含子位置及個(gè)數(shù)。

1.6 HtCHS的生物信息學(xué)分析

利 用ExPASy ProtParam tool 工 具 預(yù) 測(cè)HtCHS編碼氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)（pI）及疏水性；利用Signal P 3.0Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用TMHMM Server 2.0 進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)預(yù) 測(cè)；利 用NCBI 網(wǎng) 站 上 的CDD（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）分析HtCHS蛋白保守域。利用PredictProtein方法和SWISS-MODEL 軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與HtCHS同源性較高的同源序列，并下載相似性較高的10種植物的CHS序列，利用Culstal Omega（https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／）和Genedoc（http：／／www.ch.embnet.org／software／BOX＿form.html）進(jìn)行多重序列比對(duì)。然后用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（Maximum Likelihood Tree，Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)各分支的置信度），分支處的數(shù)字表示該分支分析的可靠程度，數(shù)值越大，可信度越高。

1.7 HtCHS 重組質(zhì)粒的獲得與鑒定

將pTOPO-B-cHtCHS 和pET-28a 分 別 使用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化目的基因片段和pET-28a載體骨架?；厥债a(chǎn)物利用Ligation high進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tran10 感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，正確的送美吉公司測(cè)序，獲得的重組原核表達(dá)載體命名為pET-28a-cHtCHS。

1.8 HtCHS 基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

利用熱激法將重組質(zhì)粒pET-28a-cHtCHS轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆過夜搖菌，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右，加入IPTG 至終濃度0.5 mmol·L-1，37 ℃分別誘導(dǎo)0、1、2 和4h，取200μL 菌液，12 000 r·min-1離心收集菌體，加入40μL 5×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后100 ℃加熱10 min，12 000r·min-1離心2min，取10μL上清液上樣進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠和12.5%分離膠）電泳檢測(cè)。

1.9 HtCHS 的組織特異性及脅迫誘導(dǎo)分析

根據(jù)HtCHS 基因和內(nèi)參基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 引物，信息見表1，內(nèi)參基因?yàn)榫沼?6SrRNA（Gen-Bank登錄號(hào)KT179742.1）［23］。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)分析HtCHS 相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量RT-PCR 反應(yīng)體系為25μL，具體參照2×Sybr Green qPCR Mix（Low ROX）說明書。實(shí)時(shí)定 量RT-PCR 程 序 為95 ℃、3 min；95 ℃、10s；63℃、10s；72℃、20s；40個(gè)循環(huán)；最后設(shè)置溶解曲線分析程序。試驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同組織表達(dá)部位、不同處理及對(duì)照樣品中的表達(dá)量。采用SPSS 13.0進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 HtCHS 基因開放閱讀框（ORF）的克隆

根據(jù)向日葵CHS 同源序列，從菊芋葉片中，RT-PCR 擴(kuò)增HtCHS 基 因，得到一條1 197bp基因片段（圖1，小條帶測(cè)序結(jié)果表明為非特異性擴(kuò)增）。將PCR 產(chǎn)物與pTOPO 平末端載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，得到一條與ORF 全長(zhǎng)大小一致的片段（圖2）。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切獲得1 865bp載體片段和1 197bp基因片段（圖3）。綜上所述，HtCHS（登錄號(hào)為MN124515）編碼398個(gè)氨基酸，成功獲得重組質(zhì)粒pTOPO-BcHtCHS。以DNA 為模板，使用CHS7peF 和CHS7peR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)1 567 bp DNA 片段，包括一個(gè)大小為370bp 的內(nèi)含子。gDNA 和cDNA 擴(kuò)增電泳圖和內(nèi)含子位置見圖1和圖4。

圖1 HtCHS 基因的PCR 與RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR and RT-PCR products of HtCHS

圖2 pTOPO-B-cHtCHS菌液PCR 產(chǎn)物檢測(cè)Fig.2 Clonal PCR detection of pTOPO-B-cHtCHS

圖3 pTOPO-B-cHtCHS載體雙酶切鑒定圖Fig.3 Digestive detection of pTOPO-B-cHtCHS plasmid

2.2 HtCHS的生物信息學(xué)分析

2.2.1 HtCHS蛋白質(zhì)序列分析 利用ExPASy ProtParam （https：／／web.expasy.org／protparam／）在線分析HtCHS蛋白的序列組成和理化性質(zhì)。HtCHS相對(duì)分子質(zhì)量為43 601.44，pI為6.33，分子式為C1938H3097N521O573S23，半衰期為30h。不穩(wěn)定指數(shù)為38.66，脂肪族指數(shù)為88.97，總平均疏水性為-0.071。該蛋白由20種氨基酸組成，含量最高的3 位分別是亮氨酸（9.5%）、甘氨 酸（9.3%）和 谷 氨 酸（7.8%）（圖5）。HtCHS 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明HtCHS氨基酸序列中含有查爾酮合成酶保守結(jié)構(gòu)域，屬于查爾酮合成酶超家族成員（圖6）。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明HtCHS 序列中無明顯的信號(hào)肽序列；蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明HtCHS無典型的跨膜區(qū)，屬于非分泌蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白α-螺旋（H）占40.45%，延伸鏈占10.05%，無規(guī)卷曲（C）占49.5%。利用Swiss-Model Workspace以6dxb.1為模板預(yù)測(cè)HtCHS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，與擬南芥查爾酮合成酶基因編碼蛋白序列一致性為85.17%，全局模型質(zhì)量評(píng)估值為95%，說明該預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確（圖7），且與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 HtCHS氨基酸組成Fig.5 Amino acid composition of HtCHS

圖6 HtCHS蛋白保守域分析Fig.6 Prediction of the conserved domain in HtCHS

2.2.2 氨基酸序列同源性分析 經(jīng)Clustal Omega比對(duì)分析，菊芋HtCHS蛋白序列與其他植物的CHS序列具有較高相似性（圖8）。圖8中不同灰度代表HtCHS 氨基酸與其他植物中CHS氨基酸的同源程度，黑色區(qū)域代表同源程度高達(dá)100%。菊芋CHS（MN124515）氨基酸序列保守性極強(qiáng)，與向日葵（Helianthus annuus，XP＿022009667.1）、松 果 菊（Echinacea pallida，APO10381.1 ）、大 麗 菊（Dahlia pinnata，BAJ14519.1）、萵 苣（Lactuca sativa，XP ＿023735557.1）、熊 膽 草（Eschenbachia blinii，AHN85848.1）、菊花（Chrysanthemum x morifolium，ABF69124.1）、北 野 菊（Chrysanthemum boreale，AGU91424.1）、山 茱 萸 變 種（Cynara cardunculus var.Scolymus，XP＿024970907.1）、紫背 菜（Gynura bicolor，BAJ17656.1）、青 蒿（Artemisia annua，PWA65027.1）的CHS 蛋白質(zhì) 的相似度分別為99.25%、96.48%、93.97%、93.22%、93.47%、92.95%、92.46%、91.46%、92.21%和91.96%，其保守性可能與其在植物體內(nèi)的功能有關(guān)。最大似然法系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菊芋CHS蛋白與向日葵聚在一個(gè)分支，與其他物種（松果菊、大麗菊、萵苣、熊膽草、菊花、北野菊、山茱萸變種、紫背菜、青蒿）CHS 蛋白未聚在一個(gè)分支，親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)（圖9）。

圖7 HtCHS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 3Dstructure prediction of the HtCHS protein

圖8 HtCHS與其他植物中CHS氨基酸序列的同源性Fig.8 Multiple sequence alignment of HtCHS with CHS from other plants indicated

圖9 HtCHS與相關(guān)物種CHS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.9 Phylogentic analysis of HtCHS and relative CHS proteins

2.3 HtCHS蛋白的原核表達(dá)

2.3.1 HtCHS 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pTOPO-B-cHtCHS與原核表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行酶切連接，通過EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定（圖10）及測(cè)序，將正確的克隆轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中。

2.3.2 將pET-28a-cHtCHS 轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）中進(jìn)行原核表達(dá) 菌落PCR 檢測(cè)含有重組質(zhì)粒pET-28a-cHtCHS的BL21（DE3）菌落，在0.5 mmol·L-1IPTG 條件下，37 ℃分別誘導(dǎo)0、1、2、4h，如圖11所示，pET-28a-cHtCHS經(jīng)誘導(dǎo)后獲得一條與預(yù)期蛋白一致（43.61ku）的特異性條帶。蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增多，在4h 時(shí)達(dá)到最高水平（圖11）。結(jié)果表明pET-28a-cHtCHS載體構(gòu)建成功，并通過IPTG誘導(dǎo)成功獲得了目的蛋白。

圖10 pET-28a-cHtCHS雙酶切檢測(cè)Fig.10 Digestive detection of pET-28a-cHtCHS plasmid

圖11 原核表達(dá)HtCHS的SDS-PAGE電泳檢測(cè)Fig.11 SDS-PAGE analyses of the recombinant HtCHS protein

2.4 HtCHS 表達(dá)分析

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析HtCHS 基因在菊芋不同組織和葉片經(jīng)干旱、高鹽處理之后的表達(dá)情況。結(jié)果表明，HtCHS 在根中表達(dá)量最高，其次是塊莖、莖和葉片（圖12）。與對(duì)照相比，150mmol·L-1NaCl和20%PEG6000處理6h時(shí)HtCHS 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），處理12h時(shí)顯著下降（P＜0.05），處理24h 時(shí)，表達(dá)量無顯著差異（圖13）。

圖12 HtCHS 在菊芋不同組織部位的表達(dá)Fig.12 Expression of HtCHSin different tissues of Helianthus tuberosus

圖13 不同脅迫條件下葉片HtCHS 基因表達(dá)Fig.13 Expression of HtCHSin leaves under different stress

3 討 論

查爾酮合成酶是調(diào)控次生代謝產(chǎn)物類黃酮合成的關(guān)鍵酶，能夠催化香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 生成柚皮素查爾酮。該產(chǎn)物在其他酶的協(xié)同作用下合成一系列黃酮類化合物。植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的積累與查爾酮合成酶的活性及表達(dá)量相關(guān)，提高CHS 基因的表達(dá)量可以增加菊芋體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的積累量。因此，克隆菊芋CHS基因并分析其在不同組織、不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)量水平有望在分子水平上調(diào)控黃酮物質(zhì)的合成。

CHS廣泛存在于各種植物中，目前各物種中均可分離到數(shù)量不同的CHS 基因［24］。本研究成功克隆到HtCHS 基因的ORF及基因組序列，基因結(jié)構(gòu)分析表明該基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，第一外顯子編碼62個(gè)氨基酸殘基，與之前報(bào)道結(jié)果相吻合［15］。CHS 在不同物種間的基因序列長(zhǎng)度差異較小，同源性較高，蛋白序列高度保守［25］。王旭等［26］對(duì)比黃秋葵與其他植物CHS序列的同源性，發(fā)現(xiàn)黃秋葵與黃蜀葵、掌葉槭、山茶、蝶豆、陸地棉、草莓CHS 序列同源性均達(dá)90%以上，其中與黃秋葵同源性最高為99.23%。本研究得到的菊芋CHS序列與其他植物的CHS序列相似性極高，與同屬向日葵（XP＿022009667.1）的同源性高達(dá)99.25%，表明其確為CHS 基因，推測(cè)HtCHS與它們亦有相似的功能，對(duì)類黃酮合成至關(guān)重要。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明HtCHS蛋白與向日葵CHS 聚于一個(gè)分支，物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與已知的分類學(xué)地位相符合?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明該蛋白無跨膜區(qū)，為可溶性蛋白。同時(shí)對(duì)HtCHS 基因進(jìn)行原核表達(dá)，為后續(xù)的蛋白純化、體外酶學(xué)分析、蛋白結(jié)晶解析等奠定了理論基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證菊芋查爾酮合成酶是否具有活性，將進(jìn)行植物表達(dá)載體構(gòu)建，侵染擬南芥查爾酮合成酶缺失突變體tt4，觀察其是否能夠回復(fù)該酶缺失的表型。

CHS 基因家族是由8～10個(gè)成員組成的多基因家族，CHS 基因在植物不同部位的表達(dá)特性有所不同［27］。本研究分析了菊芋不同器官中HtCHS 基因的mRNA 表達(dá)水平，該基因在根、葉、莖、塊莖中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高，這與黃芩中CHS 基因表達(dá)模式一致［28］。使用150 mmol·L-1NaCl和20%PEG 6000處理苗期菊芋后，HtCHS 表達(dá)水平立即增加，在處理后6h達(dá)到對(duì)照水平的13.57 倍和18.42 倍，隨之在12h分別下降至4.78倍和3.34倍，處理后24h與對(duì)照相比均無明顯變化。這表明HtCHS 參與鹽脅迫和干旱響應(yīng)。人參CHS1 參與 水楊酸、茉莉酸甲酯介導(dǎo)的防御反應(yīng)，但是對(duì)脫落酸和NaCl 處 理 沒 有 產(chǎn) 生 明 顯 反 應(yīng) 不 一 致［29］。HtCHS 參與鹽脅迫和干旱反應(yīng)結(jié)果與人參CHS1 不參與鹽脅迫結(jié)果不同，有可能與CHS為一基因家族，菊芋與人參克隆的不是同一基因，或者進(jìn)行脅迫處理時(shí)菊芋選擇葉片作為材料，而人參選擇發(fā)根作為材料有關(guān)。

近年來菊芋備受關(guān)注，但由于其為六倍體，基因組測(cè)序困難，目前尚無公開的基因組序列，無法通過生物信息學(xué)手段分析菊芋基因組中具體存在多少個(gè)查爾酮合成酶編碼基因；雖然筆者在擴(kuò)增時(shí)候發(fā)現(xiàn)有非特異性條帶出現(xiàn)，將其測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)非特異性條帶并不是查爾酮合成酶基因序列。本研究成功從菊芋葉片中克隆了HtCHS，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、組織特異性表達(dá)及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功誘導(dǎo)表達(dá)了該蛋白，對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)菊芋及類似以類黃酮為主要活性成分植物的遺傳改良、品質(zhì)改善具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。下一步將純化HtCHS 蛋白，進(jìn)行體外酶活檢測(cè)，同時(shí)構(gòu)建HtCHS 基因的植物表達(dá)載體并進(jìn)行模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證該基因功能，以期從分子水平上揭示HtCHS 基因表達(dá)與黃酮含量的關(guān)系。