核因子E2相關(guān)因子2-醌氧化還原酶1抑制ferroptosis緩解腸缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷

董 惠 胡 蓉

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是嚴(yán)重威脅重癥患者生命的常見疾病，目前仍主要依賴機(jī)械通氣治療，但療效不佳，病死率接近于 50%[1]。腸缺血再灌注(intestine ischemia reperfusion, IIR)是導(dǎo)致腸道手術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流、創(chuàng)傷與急性失血等多種臨床并發(fā)癥造成多器官損傷的主要原因。已有研究[2-3]結(jié)果表明，IIR可破壞腸道黏膜屏障，造成大量內(nèi)毒素和炎性因子釋放入血液循環(huán)，誘導(dǎo)首要被攻擊的靶器官肺臟的肺泡上皮屏障遭受破壞，使肺水轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫防御功能受損，IIR導(dǎo)致的ALI是危重病研究領(lǐng)域中的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

ferroptosis是一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡方式，因依賴鐵離子而得名，受細(xì)胞內(nèi)信號通路的嚴(yán)密調(diào)控[4]。ferroptosis作為一種非凋亡的細(xì)胞死亡模式，以脂質(zhì)活性氧(reactive oxidative species，ROS)的積累為特征[5]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的核心通路[6]。本研究通過觀察小鼠靜脈注射檸檬酸鐵或ferroptosis抑制劑ferrostatin-1后肺組織病理損傷情況,以及Nrf2-醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1]蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，探討肺損傷修復(fù)的新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會審查批準(zhǔn)(SH9H-2019-A634-1)。8周齡健康雄性野生型(WT)C57BL/6小鼠(簡稱WT小鼠)32只，均購于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Nrf2基因敲除小鼠32只，由RIKEN生物資源中心通過國家生物資源項(xiàng)目提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備和分組 取32只健康雄性WT小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、模型+鐵劑組(鐵劑組)和模型+ferroptosis抑制劑組(ferroptosis抑制劑組)，每組8只。IIR模型建立：術(shù)前禁食12 h，以戊巴比妥鈉50 mg/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉，取腹部正中切口，用無創(chuàng)血管夾阻斷腸系膜上動(dòng)脈45 min，開放再灌注 180 min。假手術(shù)組僅暴露腸系膜上動(dòng)脈，不予結(jié)扎；鐵劑組和ferroptosis抑制劑組于阻斷腸系膜上動(dòng)脈前30 min經(jīng)尾靜脈分別注射ferroptosis誘導(dǎo)劑檸檬酸鐵15 mg/kg和ferroptosis抑制劑ferrostatin-1 5 mg/kg。取32只Nrf2基因敲除小鼠(Nrf2-/-小鼠)亦分為假手術(shù)組、模型組、鐵劑組和ferroptosis抑制劑組，各組處理方法與WT小鼠一致。

1.2.2 標(biāo)本采集和肺干濕比重(W/D)計(jì)算 模型制備成功后處死小鼠，取其右上肺葉稱濕重，置于80 ℃烘箱中烘烤72 h至恒重，取出后稱干重，計(jì)算肺W/D值。

1.2.3 Western印跡法檢測肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)表達(dá) 肺組織稱重，用液氮研磨至粉末，加蛋白裂解液30 min，冰浴勻漿，4 ℃ 12 000 ×g離心5 min，取上清液，采用Bradford法行蛋白質(zhì)定量，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入一抗(Nrf2 1∶1 000，NQO1 1∶1 000)置于4 ℃封閉過夜；以Tris緩沖液沖洗膜5 min，反復(fù)3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗IgG (1∶2 000)，于室溫下孵育1 h，再以Tris緩沖液洗膜5 min，反復(fù)3次。充分洗膜后經(jīng)電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，于X線下壓片、 曝光，應(yīng)用Image J 軟件分析條帶。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Nrf2、NQO1的mRNA表達(dá) 按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，使用Prime Script realtime-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行cDNA合成。應(yīng)用CFX384實(shí)時(shí)系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)使用SYBR mix(美國Bimake公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。擴(kuò)增方案：95 ℃ 5 min的單循環(huán)；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；最后95 ℃ 10 s的單循環(huán)。完畢后，明確擴(kuò)增曲線、熔解曲線，PCR反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，利用熒光定量檢測儀計(jì)算2-ΔΔCt，分析各個(gè)樣本中Nrf2、NQO1的表達(dá)情況。引物序列：Nrf2正向引物為5’-TAG AGT CAG CAA CGT GGA AG-3’，反向引物為5’-TAT CGA GGC TGT GTC GAC TG-3’；NQO1正向引物為5’-AGG ATG GGA GGT ACT CGA ATC-3’， 反向引物為5’-TGC TAG AGA TGA CTC GGA AGG-3’；GAPDH正向引物為5’-AAG AAG GTG GTG AAG CAG G-3’，反向引物為5’-GAA GGT GGA AGA GTG GGA GT-3’。

1.2.5 肺組織病理學(xué)觀察 取小鼠新鮮左肺組織，以4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水滲透，石蠟包埋后切片，切片厚度為5 μm。經(jīng)H-E染色后置于光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察肺組織病理學(xué)變化。將每張切片分為 9 個(gè)視野，隨機(jī)選取3個(gè)視野，參照文獻(xiàn)[7]的方法通過累加各指標(biāo)相應(yīng)分?jǐn)?shù)計(jì)算肺組織損傷病理學(xué)評分評價(jià)小鼠肺損傷程度。

2 結(jié) 果

2.1 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各組肺組織病理學(xué)表現(xiàn) WT小鼠假手術(shù)組、模型組、鐵劑組、ferroptosis抑制劑組的肺組織損傷病理學(xué)評分分別為(5.00±0.50)、(8.00±0.71)、(14.75±0.35)、(3.75±0.35)分，Nrf2-/-小鼠分別為(4.75±0.35)、(11.75±0.40)、(19.25±0.76)、(4.50±0.71)分。WT小鼠、Nrf2-/-小鼠模型組和鐵劑組的肺組織損傷病理學(xué)評分分別顯著大于同種小鼠假手術(shù)組和ferroptosis抑制劑組(P值均<0.05)，鐵劑組的肺組織損傷病理學(xué)評分分別顯著大于同種小鼠模型組(P值均<0.05)；Nrf2-/-小鼠模型組和鐵劑組的肺組織損傷病理學(xué)評分分別顯著大于WT小鼠模型組和鐵劑組(P值均<0.05)。肺組織H-E染色顯示：WT小鼠和Nrf2-/-小鼠假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)正常；模型組肺毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張、充血，炎性細(xì)胞浸潤；鐵劑組肺泡壁破壞嚴(yán)重，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬；ferroptosis抑制劑組肺泡間隔增寬，組織損傷較模型組明顯減輕。Nrf2-/-小鼠模型組和鐵劑組肺損傷程度較WT小鼠模型組和鐵劑組嚴(yán)重。見圖1。

2.2 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各組肺組織W/D值 WT小鼠假手術(shù)組、模型組、鐵劑組、ferroptosis抑制劑組的肺組織W/D值分別為3.54±0.75、8.40±0.90、11.20±0.83、5.50±0.50，Nrf2-/-小鼠分別為4.23±0.35、11.60±0.90、14.02±0.55、7.13±0.42。WT小鼠、Nrf2-/-小鼠模型組和鐵劑組的肺組織W/D值分別顯著大于同種小鼠假手術(shù)組和ferroptosis抑制劑組(P值均<0.05)，鐵劑組的肺組織W/D值分別顯著大于同種小鼠模型組(P值均<0.05)；Nrf2-/-小鼠模型組和鐵劑組的肺組織W/D值分別顯著大于WT小鼠模型組和鐵劑組(P值均<0.05)。

A WT小鼠假手術(shù)組 B WT小鼠模型組 C WT小鼠鐵劑組 D WT小鼠ferroptosis抑制劑組 E Nrf2-/-小鼠假手術(shù)組 F Nrf2-/-小鼠模型組 G Nrf2-/-小鼠鐵劑組 H Nrf2-/-小鼠ferroptosis抑制劑組圖1 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各組肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(H-E染色，×200)

2.3 WT小鼠各組肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá) WT小鼠模型組和鐵劑組的肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量和mRNA相對表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)組和ferroptosis抑制劑組(P值均<0.05)，鐵劑組的肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量和mRNA相對表達(dá)量均顯著高于模型組(P值均<0.05)。見圖2和表1。

2.4 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠假手術(shù)組和模型組肺組織NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量 另取WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各8只按前述模型制備方法分別分為假手術(shù)組和模型組，每組4只。WT小鼠假手術(shù)組、模型組的肺組織NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量分別為0.12±0.03、0.27±0.05，Nrf2-/-小鼠假手術(shù)組、模型組分別為0.03±0.02、0.15±0.12。WT小鼠和Nrf2-/-小鼠模型組的肺組織NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量分別顯著高于同種小鼠假手術(shù)組(P值均<0.05)，Nrf2-/-小鼠模型組的肺組織NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量顯著低于WT小鼠模型組(P<0.05)。見圖3。

1 假手術(shù)組 2 模型組 3 鐵劑組 4 ferroptosis抑制劑組圖2 WT小鼠各組肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)情況

表1 WT小鼠各組肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)和mRNA相對表達(dá)量比較

組別Nrf2蛋白質(zhì)相對表達(dá)量NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量Nrf2 mRNA相對表達(dá)量NQO1 mRNA相對表達(dá)量假手術(shù)0.39±0.020.46±0.050.78±0.310.56±0.09模型0.70±0.03①②0.94±0.12①②3.47±0.12①②1.07±0.06①②鐵劑0.95±0.07①②③1.47±0.10①②③4.59±0.14①②③2.13±0.36①②③ferroptosis抑制劑0.39±0.010.60±0.032.29±0.370.63±0.01

與假手術(shù)組比較：①P<0.05。與ferroptosis抑制組比較：②P<0.05。與模型組比較：③P<0.05

3 討 論

作為對缺血非常敏感的器官，腸道極易因創(chuàng)傷性失血、休克、感染等各種因素誘發(fā)缺血再灌注損傷，在多器官功能障礙的病理生理發(fā)展過程中，釋放大量內(nèi)毒素和炎性因子進(jìn)入淋巴和血液循環(huán)[8]。由于腸系膜淋巴液進(jìn)入血液后首先經(jīng)過肺，故IIR后最早發(fā)生功能紊亂的臟器就是肺，如ALI和ARDS，全身多器官功能障礙中肺部表現(xiàn)最為突出[9]。IIR誘導(dǎo)的ALI發(fā)生時(shí)，腸道組織缺氧反應(yīng)性產(chǎn)生并釋放氧自由基和炎性因子，可直接導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞線粒體功能發(fā)生障礙，引起肺泡表面活性物質(zhì)減少，以及肺泡上皮鈉離子通道、Na+-K+-ATP 酶和水通道等水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能發(fā)生障礙[10]。值得關(guān)注的是，高氧化應(yīng)激狀態(tài)下大量ROS釋放，也可導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞線粒體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物堆積，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ferroptosis，加重肺損傷。本研究結(jié)果顯示,WT小鼠、Nrf2-/-小鼠模型組肺組織W/D值和肺組織損傷病理學(xué)評分均顯著高于同種小鼠假手術(shù)組，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了IIR誘導(dǎo)的ALI過程。ferroptosis是一種具有鐵離子依賴性，在小分子物質(zhì)誘導(dǎo)下發(fā)生的氧化性細(xì)胞死亡，其發(fā)生是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS生成與降解平衡失調(diào)所致[5]。ferroptosis在缺血再灌注損傷性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Gao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制谷氨酰胺代謝抑制ferroptosis能夠改善缺血再灌注引起的心肌損傷。在缺血再灌注腎損傷模型的研究[12]中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞ferroptosis顯著增加并進(jìn)一步加重腎損傷。然而，ferroptosis在ALI中作用的相關(guān)研究較少。目前僅有體外研究[13]顯示，內(nèi)毒素顯著破壞體內(nèi)鐵平衡，上調(diào)肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白水平可減輕過量鐵離子堆積引發(fā)的細(xì)胞毒性。在本研究中，分別給予小鼠靜脈注射ferroptosis誘導(dǎo)劑檸檬酸鐵15 mg/kg或ferroptosis抑制劑ferrostatin-1 5 mg/kg后，能加重或減輕小鼠肺損傷，表明ferroptosis參與IIR誘導(dǎo)的ALI進(jìn)程。

1 WT小鼠假手術(shù)組 2 WT小鼠模型組 3 Nrf2-/-小鼠假手術(shù)組 4 Nrf2-/-小鼠模型組圖3 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠假手術(shù)組和模型組肺組織NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)情況

Nrf2是普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，作為細(xì)胞內(nèi)維持氧化穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子在高氧化應(yīng)激狀態(tài)下被持續(xù)激活，通過與細(xì)胞核內(nèi)ARE結(jié)合，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄、抗氧化和抗炎蛋白翻譯，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[14]。有研究[15]結(jié)果顯示，Nrf2/血紅素加氧酶1(HO-1)/NQO1信號通路是Nrf2提高抗氧化酶活力，減輕氧化應(yīng)激損傷的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，WT小鼠模型組和鐵劑組的肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量和mRNA相對表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)組和ferroptosis抑制劑組，鐵劑組的肺組織Nrf2、NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量和mRNA相對表達(dá)量均顯著高于模型組；提示鐵劑能誘導(dǎo)Nrf2和NQO1在造模后的表達(dá)進(jìn)一步增加，而ferroptosis抑制劑則能降低其表達(dá)。同時(shí)，Nrf2-/-小鼠模型組的肺組織NQO1蛋白質(zhì)相對表達(dá)量顯著低于WT小鼠模型組，表明Nrf2是通過提高NQO1的表達(dá)來抑制ferroptosis。

綜上所述，Nrf2能夠通過增加NQO1的表達(dá)有效抑制ferroptosis，從而減輕IIR所致的ALI。