不同濃度七氟烷對人骨肉瘤saos2細胞增殖、遷移的影響及機制

李珊珊，王忠慧，楊會，全宇航，龔玲俐

云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，昆明650118

骨肉瘤是骨組織最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，青少年多發(fā)。目前骨肉瘤的治療主要是新輔助化療和手術，5年生存率為60%～70%[1]。七氟烷是常用的吸入麻醉劑，藥理研究顯示，七氟烷除了具有麻醉作用外，還可以降低缺血再灌注損傷、保護重要器官功能以及減輕炎癥反應、降低肺泡毛細血管通透性等[2～4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷的應用與腫瘤術后復發(fā)轉移有關[5]。七氟烷對不同的腫瘤細胞的作用表現(xiàn)不完全一致，且不同濃度七氟烷對同種腫瘤細胞的作用也不盡相同。臨床常用的七氟烷濃度為1.0%～5.1%。Argano等[6]報道，1.7%七氟烷可促進原發(fā)性犬乳腺癌細胞的增殖能力，但對轉移性乳腺癌細胞則表現(xiàn)為濃度依賴性的抑制作用。Bundscherer等[7]報道，5.1%七氟烷可以顯著抑制結腸癌細胞的生物活性。還有研究顯示，3.0%七氟烷對肺腺癌A549細胞的轉移潛能表現(xiàn)為抑制，但相同濃度的七氟烷則可促進卵巢癌的復發(fā)轉移[8，9]。此外，七氟烷對白血病干/祖細胞呈濃度依賴性的抑制作用[10]，而2.0%七氟烷能夠明顯促進神經(jīng)膠質(zhì)干細胞的生長[11]。2017年5月～2019年2月，我們觀察了不同濃度七氟烷對人骨肉瘤saos2細胞增殖、遷移能力的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤saos2細胞由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。七氟烷由恒瑞醫(yī)藥有限公司提供。胎牛血清購自BIOSHARP公司，RPMI1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒購自南京建成生物工程研究所。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，傷口愈合實驗使用ibidi遷移插件。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 向細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)期生長細胞，配制成1×106/mL的細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)板中，分別標記為對照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。向細胞中加入0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，按2.5×103/孔接種至96孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)后，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組分別置于特制無菌密閉容器中，容器進氣口與七氟烷麻醉機連接，出氣口與氣體分析儀連接。在達到相應的七氟烷濃度后，同時夾閉進氣口和出氣口，使細胞在七氟烷中暴露2 h。處理完畢后，從密閉容器中取出細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組不進行七氟烷氣體暴露，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h，上酶標儀，于450 nm波長下檢測吸光度A值。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.4 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。向細胞中加入0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2.5×104/mL。向ibidi插件的左右孔中各加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至融合度達90%～100%。用鑷子將傷口愈合插件拔出，PBS清洗。按照1.3的方法，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組在不同濃度的七氟烷中暴露2 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；對照組則不進行七氟烷氣體暴露，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。記錄0、12 h傷口愈合情況。采用Image J圖像分析軟件計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞上皮間質(zhì)轉化(EMT)相關蛋白及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測細胞中EMT相關蛋白E型鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及MAPK信號通路相關蛋白轉化生長因子β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達。取對數(shù)生長期細胞，按1×105/孔接種于6孔板。待細胞貼壁，按照1.3的方法，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組在不同濃度的七氟烷中暴露2 h，對照組則不進行七氟烷氣體暴露，然后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取各組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE電泳液，電泳后轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉，4 ℃搖床過夜。棄封閉液，清洗，加入TBST溶液1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。加入5%脫脂奶粉TBST溶液1∶2 000稀釋的抗兔抗體，室溫搖床2 h。TBST洗滌后，加入適量顯影劑，觀察圖像并拍照，采用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析。以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 對照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組的細胞增殖抑制率分別為0、9.35%±1.23%、14.36%±2.46%、19.26%±3.71%，不同濃度七氟烷組細胞增殖抑制率均高于對照組，5.1%七氟烷組增殖抑制率高于1.7%、3.4%七氟烷組，3.4%七氟烷組高于1.7%七氟烷組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞遷移能力比較 對照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組劃痕愈合率分別為86.27%±4.56%、59.71%±2.34%、56.10%±2.81%、23.42%±7.13%。七氟烷組劃痕愈合率低于對照組，5.1%七氟烷組劃痕愈合率低于1.7%、3.4%七氟烷組(P均<0.05)。

2.3 各組細胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表達比較 與對照組相比，七氟烷組Ecadherin蛋白表達升高，Vimentin、TGF-β1、MMP-2表達降低(P<0.05)。5.1%七氟烷組E-cadherin蛋白表達較1.7%、3.4%七氟烷組升高，Vimentin、TGF-β1、MMP-2表達較1.7%、3.4%七氟烷組降低(P均<0.05)。1.7%七氟烷組與3.4%七氟烷組比較亦有統(tǒng)計學差異(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與1.7%七氟烷組比較，#P<0.05；與3.4%七氟烷組比較，△P<0.05。

3 討論

對于早、中期實體腫瘤，手術切除可顯著延長患者壽命、提高患者生存質(zhì)量，但手術及創(chuàng)傷也能促進新的腫瘤轉移灶形成和加快微小病灶的發(fā)展。對于腫瘤手術患者而言，麻醉方式及方法的不同可能會影響腫瘤生長，一定程度上也影響到患者預后。七氟烷因其誘導迅速、可控性高等優(yōu)點而廣泛用于手術麻醉。有研究證實，七氟烷除麻醉作用外，還可通過減少心肌細胞、神經(jīng)元或腎小管上皮細胞凋亡，對心、腦、肺、腎等重要器官的缺血再灌注損傷具有保護作用，從而降低宿主器官損傷。七氟烷影響腫瘤生長的可能機制主要包括血小板活化[12]、誘導凋亡小體產(chǎn)生[13]以及Ras/ERK、TGF/Smad3和PI3K/AKT等信號通路的激活[14]等。

多項體外細胞實驗和動物實驗表明，七氟烷可通過多種機制促進或抑制腫瘤增殖。本研究結果顯示，不同濃度七氟烷組細胞增殖抑制率均高于對照組，以5.1%七氟烷的抑制作用最強，3.4%七氟烷組次之。表明不同濃度的七氟烷均能夠抑制saos2細胞增殖，且濃度越高，作用越強。Ciechanowicz等[15]報道，肺癌A549細胞在3.6%七氟烷暴露2 h后，其增殖活力受到明顯抑制，同時還能增加順鉑化療敏感性，其機制與上調(diào)TGF-β1信號通路中的下游分子Smad3的核內(nèi)水平有關；但相同濃度的七氟烷在腎癌Rcc4細胞中的作用相反，可使Rcc4細胞增殖增強，促進腎癌轉移的潛能。本研究結果顯示，1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能降低saos2細胞TGF-β1表達，從而達到抑制其惡性潛能的作用。

腫瘤的轉移能力與腫瘤細胞的遷移能力密切相關。本研究結果顯示，不同濃度七氟烷組劃痕愈合率均低于對照組，5.1%七氟烷組低于1.7%、3.4%七氟烷組，表明1.7%、3.4%、5.1%七氟烷均能夠抑制saos2細胞遷移，而5.1%七氟烷的抑制作用最強。Fan等[16]報道，1%～4%七氟烷均能夠抑制結直腸癌SW620細胞和HCT116細胞的侵襲和遷移能力，其機制是通過上調(diào)miR-203而起到調(diào)節(jié)ERK/MMP-9信號通路的作用。本研究中也同樣驗證了七氟烷對骨肉瘤saos2細胞中MMP家族中的MMP-2有抑制作用。

EMT是腫瘤侵襲、轉移過程及腫瘤產(chǎn)生耐藥性的關鍵步驟，腫瘤的惡性程度直接由腫瘤細胞EMT的程度所決定[17]。E-cadherin是一種細胞膜黏附蛋白，當惡性腫瘤細胞E-cadherin蛋白表達下調(diào)時，細胞極性會消失，從而使腫瘤細胞獲得侵襲轉移的能力；當腫瘤細胞Vimentin蛋白表達上調(diào)時，則提示其由上皮細胞表型轉變?yōu)殚g質(zhì)細胞表型[18]。本研究結果顯示，不同濃度七氟烷處理saos2細胞后，E-cadherin蛋白上調(diào)、Vimentin蛋白下調(diào)，表明七氟烷能有效抑制saos2細胞EMT相關蛋白表達。

綜上所述，1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能夠抑制人骨肉瘤saos2細胞的增殖和遷移能力，其中以5.1%七氟烷作用最強；其機制可能與抑制細胞EMT以及下調(diào)MAPK信號通路活性有關。但體外細胞實驗與臨床實際存在很大差距，關于七氟烷對人體骨肉瘤的影響仍需動物實驗和臨床研究進一步闡明。