不同濃度七氟烷對人骨肉瘤saos2細胞增殖、遷移的影響及機制

李珊珊，王忠慧，楊會，全宇航，龔玲俐

云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，昆明650118

骨肉瘤是骨組織最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，青少年多發(fā)。目前骨肉瘤的治療主要是新輔助化療和手術(shù)，5年生存率為60%～70%[1]。七氟烷是常用的吸入麻醉劑，藥理研究顯示，七氟烷除了具有麻醉作用外，還可以降低缺血再灌注損傷、保護重要器官功能以及減輕炎癥反應(yīng)、降低肺泡毛細血管通透性等[2～4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷的應(yīng)用與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。七氟烷對不同的腫瘤細胞的作用表現(xiàn)不完全一致，且不同濃度七氟烷對同種腫瘤細胞的作用也不盡相同。臨床常用的七氟烷濃度為1.0%～5.1%。Argano等[6]報道，1.7%七氟烷可促進原發(fā)性犬乳腺癌細胞的增殖能力，但對轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞則表現(xiàn)為濃度依賴性的抑制作用。Bundscherer等[7]報道，5.1%七氟烷可以顯著抑制結(jié)腸癌細胞的生物活性。還有研究顯示，3.0%七氟烷對肺腺癌A549細胞的轉(zhuǎn)移潛能表現(xiàn)為抑制，但相同濃度的七氟烷則可促進卵巢癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[8，9]。此外，七氟烷對白血病干/祖細胞呈濃度依賴性的抑制作用[10]，而2.0%七氟烷能夠明顯促進神經(jīng)膠質(zhì)干細胞的生長[11]。2017年5月～2019年2月，我們觀察了不同濃度七氟烷對人骨肉瘤saos2細胞增殖、遷移能力的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤saos2細胞由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。七氟烷由恒瑞醫(yī)藥有限公司提供。胎牛血清購自BIOSHARP公司，RPMI1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒購自南京建成生物工程研究所。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，傷口愈合實驗使用ibidi遷移插件。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 向細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)期生長細胞，配制成1×106/mL的細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)板中，分別標記為對照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。向細胞中加入0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，按2.5×103/孔接種至96孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)后，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組分別置于特制無菌密閉容器中，容器進氣口與七氟烷麻醉機連接，出氣口與氣體分析儀連接。在達到相應(yīng)的七氟烷濃度后，同時夾閉進氣口和出氣口，使細胞在七氟烷中暴露2 h。處理完畢后，從密閉容器中取出細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組不進行七氟烷氣體暴露，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h，上酶標儀，于450 nm波長下檢測吸光度A值。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。向細胞中加入0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2.5×104/mL。向ibidi插件的左右孔中各加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至融合度達90%～100%。用鑷子將傷口愈合插件拔出，PBS清洗。按照1.3的方法，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組在不同濃度的七氟烷中暴露2 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；對照組則不進行七氟烷氣體暴露，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。記錄0、12 h傷口愈合情況。采用Image J圖像分析軟件計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測細胞中EMT相關(guān)蛋白E型鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及MAPK信號通路相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達。取對數(shù)生長期細胞，按1×105/孔接種于6孔板。待細胞貼壁，按照1.3的方法，將1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組在不同濃度的七氟烷中暴露2 h，對照組則不進行七氟烷氣體暴露，然后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取各組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE電泳液，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉，4 ℃搖床過夜。棄封閉液，清洗，加入TBST溶液1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。加入5%脫脂奶粉TBST溶液1∶2 000稀釋的抗兔抗體，室溫搖床2 h。TBST洗滌后，加入適量顯影劑，觀察圖像并拍照，采用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析。以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 對照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組的細胞增殖抑制率分別為0、9.35%±1.23%、14.36%±2.46%、19.26%±3.71%，不同濃度七氟烷組細胞增殖抑制率均高于對照組，5.1%七氟烷組增殖抑制率高于1.7%、3.4%七氟烷組，3.4%七氟烷組高于1.7%七氟烷組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞遷移能力比較 對照組、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組劃痕愈合率分別為86.27%±4.56%、59.71%±2.34%、56.10%±2.81%、23.42%±7.13%。七氟烷組劃痕愈合率低于對照組，5.1%七氟烷組劃痕愈合率低于1.7%、3.4%七氟烷組(P均<0.05)。

2.3 各組細胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表達比較 與對照組相比，七氟烷組Ecadherin蛋白表達升高，Vimentin、TGF-β1、MMP-2表達降低(P<0.05)。5.1%七氟烷組E-cadherin蛋白表達較1.7%、3.4%七氟烷組升高，Vimentin、TGF-β1、MMP-2表達較1.7%、3.4%七氟烷組降低(P均<0.05)。1.7%七氟烷組與3.4%七氟烷組比較亦有統(tǒng)計學差異(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、MMP-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與1.7%七氟烷組比較，#P<0.05；與3.4%七氟烷組比較，△P<0.05。

3 討論

對于早、中期實體腫瘤，手術(shù)切除可顯著延長患者壽命、提高患者生存質(zhì)量，但手術(shù)及創(chuàng)傷也能促進新的腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成和加快微小病灶的發(fā)展。對于腫瘤手術(shù)患者而言，麻醉方式及方法的不同可能會影響腫瘤生長，一定程度上也影響到患者預(yù)后。七氟烷因其誘導(dǎo)迅速、可控性高等優(yōu)點而廣泛用于手術(shù)麻醉。有研究證實，七氟烷除麻醉作用外，還可通過減少心肌細胞、神經(jīng)元或腎小管上皮細胞凋亡，對心、腦、肺、腎等重要器官的缺血再灌注損傷具有保護作用，從而降低宿主器官損傷。七氟烷影響腫瘤生長的可能機制主要包括血小板活化[12]、誘導(dǎo)凋亡小體產(chǎn)生[13]以及Ras/ERK、TGF/Smad3和PI3K/AKT等信號通路的激活[14]等。

多項體外細胞實驗和動物實驗表明，七氟烷可通過多種機制促進或抑制腫瘤增殖。本研究結(jié)果顯示，不同濃度七氟烷組細胞增殖抑制率均高于對照組，以5.1%七氟烷的抑制作用最強，3.4%七氟烷組次之。表明不同濃度的七氟烷均能夠抑制saos2細胞增殖，且濃度越高，作用越強。Ciechanowicz等[15]報道，肺癌A549細胞在3.6%七氟烷暴露2 h后，其增殖活力受到明顯抑制，同時還能增加順鉑化療敏感性，其機制與上調(diào)TGF-β1信號通路中的下游分子Smad3的核內(nèi)水平有關(guān)；但相同濃度的七氟烷在腎癌Rcc4細胞中的作用相反，可使Rcc4細胞增殖增強，促進腎癌轉(zhuǎn)移的潛能。本研究結(jié)果顯示，1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能降低saos2細胞TGF-β1表達，從而達到抑制其惡性潛能的作用。

腫瘤的轉(zhuǎn)移能力與腫瘤細胞的遷移能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度七氟烷組劃痕愈合率均低于對照組，5.1%七氟烷組低于1.7%、3.4%七氟烷組，表明1.7%、3.4%、5.1%七氟烷均能夠抑制saos2細胞遷移，而5.1%七氟烷的抑制作用最強。Fan等[16]報道，1%～4%七氟烷均能夠抑制結(jié)直腸癌SW620細胞和HCT116細胞的侵襲和遷移能力，其機制是通過上調(diào)miR-203而起到調(diào)節(jié)ERK/MMP-9信號通路的作用。本研究中也同樣驗證了七氟烷對骨肉瘤saos2細胞中MMP家族中的MMP-2有抑制作用。

EMT是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程及腫瘤產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵步驟，腫瘤的惡性程度直接由腫瘤細胞EMT的程度所決定[17]。E-cadherin是一種細胞膜黏附蛋白，當惡性腫瘤細胞E-cadherin蛋白表達下調(diào)時，細胞極性會消失，從而使腫瘤細胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移的能力；當腫瘤細胞Vimentin蛋白表達上調(diào)時，則提示其由上皮細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞表型[18]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度七氟烷處理saos2細胞后，E-cadherin蛋白上調(diào)、Vimentin蛋白下調(diào)，表明七氟烷能有效抑制saos2細胞EMT相關(guān)蛋白表達。

綜上所述，1.7%、3.4%、5.1%的七氟烷均能夠抑制人骨肉瘤saos2細胞的增殖和遷移能力，其中以5.1%七氟烷作用最強；其機制可能與抑制細胞EMT以及下調(diào)MAPK信號通路活性有關(guān)。但體外細胞實驗與臨床實際存在很大差距，關(guān)于七氟烷對人體骨肉瘤的影響仍需動物實驗和臨床研究進一步闡明。