HPLC法測(cè)定鼻炎康膠囊中歐前胡素的含量

馬海平，王 曼，許 尚，朱 軍

(1.長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 仙桃 433000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北 十堰 442008)

鼻炎康膠囊是湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院的制劑產(chǎn)品，收載于《湖北省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范(2011年版)》，是由蒼耳子、白芷、薄荷、辛荑、桑白皮、黃芩、金銀花共7味藥材經(jīng)煎煮、濃縮、干燥而成的硬膠囊劑中成藥，內(nèi)容物為土黃色粉末，味微苦。具有消風(fēng)散炎、宜通鼻竅的功效，可用于鼻塞流涕、鼻炎、鼻竇炎及過(guò)敏性鼻炎的治療。鼻炎康膠囊隸屬本院自制制劑，目前其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)只有相應(yīng)藥材的薄層色譜鑒定和浸出物含量。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)寬松，缺少有效的含量測(cè)定方法來(lái)評(píng)估藥品藥效和安全性。白芷作為本處方中的主藥之一，是鼻炎康膠囊發(fā)揮療效的重要成分和保證。

白芷為傘形科當(dāng)歸屬植物，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，名白，芳香，列為中品，性溫，味辛。具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效[1]。白芷中含有豐富的異歐前胡素、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、珊瑚菜素、氧化前胡素等多種有機(jī)酸類成分[2]。

歐前胡素又名白芷乙素，屬于6，7-呋喃香豆素類化合物，廣泛存在于白芷、歐前胡、當(dāng)歸、蛇床等藥用植物中，分子式C16H14O4，分子量270.209 96。性狀為白色粉末，不溶于水，易溶于弱極性有機(jī)溶劑，為重要的天然活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗腫瘤和抑制心肌肥大等藥理作用[3]。臨床上廣泛應(yīng)用于藿香正氣水、龍葵銀消片和元胡止痛片等多種中藥復(fù)方制劑，是大鼠經(jīng)胃白芷提取液后血漿中的主要成分[4]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典(一部)》已建立了中藥材白芷的相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，即利用高效液相色譜法測(cè)定白芷中歐前胡素的含量。本實(shí)驗(yàn)參考該法，擬通過(guò)建立鼻炎康膠囊中歐前胡素含量測(cè)定的高效液相色譜法，建立全面可靠的鼻炎康膠囊制劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為患者提供安全有效的醫(yī)院制劑產(chǎn)品。

1 儀器與耗材

1.1 儀器

P1201型高效液相色譜儀(大連依利特)，UV230Ⅱ紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，AL204電子分析天平(梅特勒/精確度1×10-4g)，超聲波清洗器(KQ-50B)，移液槍(100-1 000 μL，賽默飛)。

1.2 耗材

歐前胡素對(duì)照品(上海源葉，99.8%，供含量測(cè)定用)；甲醇(色譜純，SIMARK)、水(純化水自制)、定量濾紙(雙圈11 cm)、微孔濾膜(Merck有機(jī)系0.45 μm)、一次性無(wú)菌注射器(5 mL)。

樣品：鼻炎康膠囊1批次若干瓶(仙桃市第一人民醫(yī)院制劑室制劑產(chǎn)品，0.4 g×20粒/瓶，批號(hào)20190203。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18色譜柱，規(guī)格：250 mm×4.6 mm/5 μm；流動(dòng)相為甲醇：水(55∶45)；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按歐前胡素計(jì)算不得低于3 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對(duì)照品0.020 8 g于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(2.080 mg/mL)。分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8、2 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品中間液(33.28、83.2 g/mL)，分別精密量取上述83.20 μg/mL對(duì)照品中間液1.25、2.50、5.00 mL于50 mL的容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，制成2.080、4.160、8.320 g/mL系列濃度梯度工作液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5粒，精密稱定內(nèi)容物重量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇45 mL，超聲處理60 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，定量濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液適量，用0.45 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，濾液用進(jìn)樣瓶收集，上機(jī)備用。

3 方法的驗(yàn)證與確認(rèn)

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性分析

分別精密吸取上述“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液及“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分析，歐前胡素對(duì)照品及鼻炎康膠囊供試品歐前胡素色譜見(jiàn)圖1(1號(hào)圖譜為供試品圖譜，2號(hào)圖譜為對(duì)照品圖譜)。結(jié)果顯示，在保留時(shí)間32.8 min處，對(duì)照品與供試品均出現(xiàn)一色譜峰，出峰時(shí)間高度重疊，峰形無(wú)明顯拖尾或前沿(拖尾因子1.01)，且供試品歐前胡素峰周圍基線平整，無(wú)明顯噪音或雜峰干擾，分離度5.29，理論塔板數(shù)85 496。結(jié)果表明，采用上述“2.1”項(xiàng)HPLC分離方法能夠有效分離鼻炎康膠囊中的歐前胡素成分。

圖1 歐前胡素對(duì)照品與鼻炎康膠囊供試品圖譜

3.2 空白分析

3.2.1 標(biāo)樣空白 按以上“2.2.1”項(xiàng)所述，以超純水替代歐前胡素對(duì)照品配制標(biāo)準(zhǔn)樣品空白，按以上“2.1”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品空白圖譜。如圖2所示(1號(hào)圖譜為對(duì)照品圖譜，2號(hào)圖譜為標(biāo)樣空白圖譜)，標(biāo)準(zhǔn)樣品空白基線平整，噪音0.02 mV，漂移0.11 mV/30 min，圖譜無(wú)雜質(zhì)峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，對(duì)照品配制所用試劑對(duì)目標(biāo)峰無(wú)干擾。

圖2 標(biāo)樣空白/對(duì)照品圖譜

3.2.2 試劑空白 按以上“2.2.2”項(xiàng)所述，以純水替代鼻炎康膠囊供試品配制試劑空白，按以上“2.1”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣，得到試劑空白圖譜。如圖3所示(1號(hào)圖譜為對(duì)照品圖譜，2號(hào)圖譜為試劑空白圖譜)，試劑空白在出峰時(shí)間32.8 min附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，供試品前處理所用器皿和試劑未對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾。

圖3 試劑空白/對(duì)照品圖譜

3.2.3 樣品空白 按以上“2.2.2”項(xiàng)所述，以在制劑工藝中不添加白芷原藥材(其余制劑工藝不變)所生產(chǎn)的膠囊替代正常制劑工藝生產(chǎn)的該批次鼻炎康膠囊作為供試品制備樣品空白，按以上“2.1”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣，得到樣品空白圖譜。如圖4所示(1號(hào)圖譜為對(duì)照品圖譜，2號(hào)圖譜為樣品空白圖譜)，樣品空白在出峰時(shí)間32.8 min附近基線平整，無(wú)干擾峰出現(xiàn)。

圖4 樣品空白/對(duì)照品圖譜

3.2.4 結(jié)論 本次實(shí)驗(yàn)所用試劑、器皿以及鼻炎康膠囊內(nèi)除白芷外的基質(zhì)未在歐前胡素目標(biāo)峰附近產(chǎn)生干擾，結(jié)合峰形判斷，在32.8 min出現(xiàn)的峰為單一組分峰，組分物質(zhì)為歐前胡素。

3.3 線性關(guān)系

按以上“2.2.1”項(xiàng)所述，分別配置濃度為2.080、4.160、8.320、33.28、83.20 μg/mL系列梯度工作液，并按以上“2.1”項(xiàng)所述色譜條件依次進(jìn)樣。在保留時(shí)間32.8 min處，出現(xiàn)峰面積與進(jìn)樣濃度呈線性相關(guān)的色譜峰組，該峰即為歐前胡素目標(biāo)峰。以峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，以對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A=20.308C+8.818 3(R2=0.999 8)，如圖5所示。結(jié)果表明，歐前胡素在該分析條件下，在2.080～83.20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，其峰面積與其濃度線性相關(guān)性良好，滿足定量要求，如表1所示。

圖5 歐前胡素濃度-峰面積曲線

表1 歐前胡素濃度-峰面積曲線

3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考Horwitz方程[5]：CV=2(1-0.5lgw)，其中CV為變異系數(shù)，w為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用10的冪次指數(shù)表示，例如含量為1 mg/kg時(shí)，w=10-6。本次供試品鼻炎康膠囊中歐前胡素含量約為0.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于3.7%。重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)暫定為該標(biāo)準(zhǔn)的1/3，即重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于1.2%，期間再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于3.7%。

3.4.1 重復(fù)性 按以上“2.2.2”項(xiàng)所述操作，制得一個(gè)供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，數(shù)據(jù)如表2所示。結(jié)果表明，在重復(fù)性條件下，樣品、方法、儀器重復(fù)性良好，峰面積RSD=0.05%<1.2%目標(biāo)值。保留時(shí)間無(wú)漂移現(xiàn)象，證明甲醇-水(55∶45)的流動(dòng)相在分離體系中容易達(dá)到平衡且系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。

3.4.2 期間再現(xiàn)性 取同批次鼻炎康膠囊若干粒，取出內(nèi)容物混勻，每次精密稱定2.000 g，共6次，置于50 mL容量瓶中，其后按以上“2.2.2”項(xiàng)所述操作，共制得6個(gè)供試品，每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次，峰面積取平均值。以上6次實(shí)驗(yàn)由6名不同質(zhì)檢員分別在6周內(nèi)每周重復(fù)一次完成，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。結(jié)果如表4所示，期間再現(xiàn)性RSD=0.78%<3.7%，符合要求。即該方法在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，具有一定的人員和時(shí)間再現(xiàn)性。

表3 期間再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 重復(fù)性數(shù)據(jù)

3.5 檢出限和定量限

本法未做檢出限和定量限相關(guān)系統(tǒng)性分析。供試品鼻炎康膠囊中歐前胡素含量約為0.1%(以內(nèi)容物計(jì))，按照稱樣量2 g，定容體積50 mL，稀釋倍數(shù)為1條件處理，上機(jī)濃度約為30 mg/kg，在線性范圍內(nèi)。本法按標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)暫定為定量下限，即LOQ=50 mg/kg，LOD=15 mg/kg(按定量限1/3計(jì)算)。該數(shù)據(jù)僅供參考，在沒(méi)有明顯基質(zhì)噪音干擾的情況下，實(shí)際檢出限和定量限應(yīng)顯著低于該擬定值，不同的供試品基質(zhì)具有不同的噪音水平，所得結(jié)果不同，不具有普適性。

3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3.6.1 樣品穩(wěn)定性 鼻炎康膠囊作為仙桃市第一人民醫(yī)院制劑產(chǎn)品，保質(zhì)期為6個(gè)月，儲(chǔ)存條件為陰涼避光。按照該條件對(duì)同一批次的鼻炎康膠囊留樣，由同一名實(shí)驗(yàn)員每月定期進(jìn)行歐前胡素含量穩(wěn)定性測(cè)試跟蹤，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3平行操作，含量取平均值。如表5所示，結(jié)果表明，在保質(zhì)期內(nèi)，鼻炎康膠囊中歐前胡素含量未隨時(shí)間推移出現(xiàn)顯著的趨勢(shì)性變化。即鼻炎康膠囊樣品在有效期內(nèi)具有穩(wěn)定性。

表5 鼻炎康樣品穩(wěn)定性跟蹤

3.6.2 樣品處理液穩(wěn)定性 取同一批次鼻炎康膠囊，按以上“2.2.2”項(xiàng)操作，得上機(jī)液，分別封裝于若干樣品瓶中，常溫避光保存。按以上“2.1”項(xiàng)所述間隔一定時(shí)間重復(fù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣2次，取峰面積平均值，進(jìn)行穩(wěn)定性跟蹤分析，結(jié)果如表6 所示。供試品處理液以甲醇為溶劑，在密封條件下，48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)第3天，處理液出現(xiàn)渾濁，未進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。因此，建議同一批次檢驗(yàn)工作在2天內(nèi)完成。

表6 處理液穩(wěn)定性跟蹤

3.6.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性 按以上“2.2.1”項(xiàng)所述，制備濃度為8.320 μg/mL對(duì)照品溶液，分裝于若干樣品瓶中，分別冷凍、冷藏和常溫保存，定期上機(jī)檢測(cè)(上機(jī)前恢復(fù)至室溫)，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，記錄峰面積取平均值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性跟蹤

結(jié)果表明，三種儲(chǔ)存條件下的歐前胡素對(duì)照品峰面積均未隨時(shí)間出現(xiàn)趨勢(shì)性變化。在密封條件下，歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇為溶劑，在常溫、冷藏和冷凍溫度下均具有較好的穩(wěn)定性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明的有效期可達(dá)3個(gè)月。

3.7 準(zhǔn)確性

由于沒(méi)有相應(yīng)的市售鼻炎康基質(zhì)質(zhì)控樣品，本次準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)采用回收率測(cè)試。

取同批次鼻炎康膠囊若干粒，取出內(nèi)容物混勻，每次精密稱定2.000 g，從置于50 mL容量瓶中起，按以上“2.2.2”項(xiàng)所述操作，測(cè)定內(nèi)容物歐前胡素本底含量，重復(fù)6次取平均值，結(jié)果以mg/g計(jì)。

另精密稱定內(nèi)容物2.000 g，置于50 mL容量瓶中，加入一定量歐前胡素對(duì)照品，按以上“2.2.2”項(xiàng)所述操作，測(cè)定加標(biāo)樣品歐前胡素含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。加標(biāo)濃度為本底含量的1/3(因本法中歐前胡素有檢出，且含量較高，因此未進(jìn)行檢出限加標(biāo)回收測(cè)試)，加標(biāo)方式為歐前胡素儲(chǔ)備液2.080 mg/mL×0.25 mL。每個(gè)加標(biāo)濃度重復(fù)6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

在本底含量1/3處進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，回收率均值為99.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差1.09%，本次回收率的測(cè)量不確定度按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算可得U=3.27%，即回收率范圍為95.83%～102.37%，與100%沒(méi)有顯著性差異。該結(jié)果表明，本法不存在系統(tǒng)性偏差，準(zhǔn)確性符合要求。

表8 加標(biāo)回收率

4 討論與分析

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外全波長(zhǎng)掃描，歐前胡素供試品溶液在300 nm處有最大吸收，靈敏度達(dá)到定量要求，因此將檢測(cè)器波長(zhǎng)定為300 nm。

4.2 溶劑的選擇

歐前胡素不溶于水，易溶于弱極性有機(jī)溶劑，在甲醇中溶解性良好，以甲醇為提取溶劑的提取效果優(yōu)于乙醇[6]。本法樣品前處理和對(duì)照品均以甲醇為溶媒，甲醇不僅可以充分有效萃取鼻炎康膠囊內(nèi)容物中的歐前胡素(超聲萃取1 h后萃取液中歐前胡素含量不再增加，表明內(nèi)容物中歐前胡素已萃取完全[7])，還能起到沉淀劑作用，沉淀難溶性雜質(zhì)。經(jīng)甲醇萃取后的續(xù)濾液為黃色澄明液體。對(duì)于部分基質(zhì)顆粒較大供試品，建議先研磨過(guò)20目篩后再處理[8]，以增加萃取效率，也可采取冷凝回流法[9]或適當(dāng)延長(zhǎng)超聲萃取時(shí)間。本法萃取液的體積使用量為50 mL，一般使用6倍量體積的甲醇萃取效果較好[10]，需綜合考慮上機(jī)濃度等因素。

4.3 流動(dòng)相的選擇

本法采用甲醇∶水=55∶45作為流動(dòng)相，出峰時(shí)間32.8 min，理論塔板數(shù)符合要求，與相鄰色譜峰有效分離，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，如圖6所示。

圖6 鼻炎康膠囊歐前胡素色譜

鼻炎康為復(fù)方制劑，七味藥材經(jīng)甲醇萃取后處理液組分復(fù)雜，雜質(zhì)峰較多，從圖譜可以看出，在26 min前雜質(zhì)峰出現(xiàn)頻繁。歐前胡素為弱極性物質(zhì)，提高甲醇比例后在流動(dòng)相中的分配系數(shù)增加，保留時(shí)間縮短，對(duì)pH不敏感。甲醇比例每提高1%，保留時(shí)間隨之減少5%。本法甲醇比例可以適當(dāng)提高，以縮短出峰時(shí)間，減小峰展寬，但比例不宜超過(guò)60∶40，過(guò)高甲醇比例可能導(dǎo)致分離度降低，甚至雜質(zhì)峰干擾。相反的，降低甲醇比例可以有效避免極性相對(duì)較高的雜質(zhì)組分干擾，然而保留時(shí)間延長(zhǎng)將導(dǎo)致峰展寬，基線噪音干擾，以及分析時(shí)間增加等問(wèn)題。

4.4 鼻炎康膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

鼻炎康膠囊是臨床常用的用于治療慢性鼻炎和鼻竇炎的藥物，在《湖北省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范(2011年版)》中，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚只有白芷的薄層鑒別[11]，然而白芷藥材的TLC鑒別易受復(fù)方制劑中其他藥材的干擾，檢測(cè)結(jié)果不明顯。且單純的鑒別檢測(cè)并不能保證藥品的有效性和安全性。有文獻(xiàn)表明，歐前胡素?cái)z入過(guò)量將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)毒性，并具有給藥部位的局部刺激性[12]。建立可行有效的含量測(cè)定方法是當(dāng)前鼻炎康制劑質(zhì)量控制的當(dāng)務(wù)之急。

本文探索的鼻炎康膠囊中歐前胡素含量測(cè)定高效液相色譜法，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的方法學(xué)研究，具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，且簡(jiǎn)單易行，是對(duì)鼻炎康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效補(bǔ)充，為鼻炎康膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。