天麻鉤藤飲多糖的提取與分離純化研究

張 鑫，安加文，王文佳，劉思海，蔡遠(yuǎn)俊，王珊珊，梁建東

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

天麻鉤藤飲由天麻、鉤藤、石決明(生)、山梔、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、茯苓組成，具有平肝熄風(fēng)、清熱瀉火、益腎活血的功效，可治療高脂血癥、高血壓、腦出血、偏頭痛、內(nèi)耳性眩暈等疾病[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻鉤藤飲具有提高機(jī)體抗氧化能力，降低血壓，抑制心肌重構(gòu)等作用[3]。天麻鉤藤飲發(fā)揮降血脂、抗氧化性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，但組方藥物中多含有多糖類物質(zhì)。植物多糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗衰老、抗腫瘤等作用[4-5]。目前對中醫(yī)方劑中多糖的研究已成為熱點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)對天麻鉤藤飲中的多糖進(jìn)行提取與分離純化研究，為天麻鉤藤飲及天麻鉤藤飲多糖的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

1510酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)，TD5A-WS離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)，PL303分析天平(梅特勒上海有限公司)，HZQ-QB搖床(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，移液槍(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司)。

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑 考馬斯亮藍(lán)G-250(北京索萊寶科技有限公司，批號：20190315)、牛血清蛋白(愛必信上海生物科技有限公司，批號：JB25)、葡萄糖(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20180530)、無水乙醇(重慶川東化工有限公司，批號：20190101)、磷酸(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號：20161006)、苯酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20171020)、濃硫酸(重慶川東化工有限公司，批號：20160501)、木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司，批號：122E021)、鹽酸(重慶川東化工有限公司，批號：20190101)。以上所有試劑均為分析純。蒸餾水(自制)。葡萄糖凝膠G-100(北京索萊寶科技有限公司，批號：20180709)。

1.2.2 材料 天麻、鉤藤、石決明(生)、山梔、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯苓，均購買自貴州一品藥業(yè)連鎖有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取25 mg葡萄糖至25 mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容，搖勻，配得1 mg/mL葡萄糖溶液。精密吸取該葡萄糖溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于25 mL量瓶中，蒸餾水定容。精密吸取各濃度葡萄糖溶液1.0 mL于干燥試管中，加入1.0 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速加入6 mL濃硫酸，搖勻，冷卻后于490 nm波長處測量其吸光度，以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 天麻鉤藤飲粗多糖提取條件優(yōu)化 分別稱取天麻、山梔、黃芩、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯苓各9 g，鉤藤、川牛膝各12 g，生石決明18 g，于燒杯中加水浸泡30 min，再進(jìn)行煎煮，微沸保持一定時間，煎煮數(shù)次，每次加入一定比例水，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心(4 000 r/5 min)，沉淀干燥即得粗多糖[6]。

(1)料液比。本實(shí)驗(yàn)采用煎煮法，故不考慮溫度的影響。稱取3組復(fù)方藥物量，分別加入15倍水、20倍水、30倍水煎煮30 min，煎煮完后倒出藥液，重新加入15、20、30倍蒸餾水，煎煮3次，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

(2)煎煮時間。稱取4組天麻鉤藤飲藥物量，加入20倍蒸餾水煎煮，4組藥物分別煎煮20 min、30 min、40 min、50 min，每次煎煮完后倒出藥液，重新加入20倍水，煎煮3次，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

(3)煎煮次數(shù)。稱取4組天麻鉤藤飲藥物量，加入20倍蒸餾水煎煮，將4組藥物分別煎煮2、3、4、5次，每次煎煮30 min，每次煎煮完后倒出藥液，重新加入20倍水，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.3 純化粗多糖(酶法去除蛋白質(zhì)) 稱定500 mg天麻鉤藤飲粗多糖，分別溶于500 mL蒸餾水中，待其充分溶解后，備用。

(1)酶用量。取6組粗多糖，分別加入0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的木瓜蛋白酶，搖勻，于50 ℃下水浴40 min后，置沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

(2)酶解時間。取5組粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，搖勻，分別于50 ℃下水浴酶解20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，酶解完成后置于沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

(3)酶解溫度。取8組粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，搖勻，分別于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃溫度下酶解40 min。酶解完成后置于沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

(4)酶解pH。取8組粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，搖勻，調(diào)節(jié)pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11，于50 ℃下水浴酶解40 min后，置沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

1.3.4 分離純化后多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定[7]。

1.3.5 分離純化后蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定[8]。

1.3.6 粗多糖的分離 將天麻鉤藤飲粗多糖配制成1 mg/mL的溶液，通過SephadexG-100層析柱進(jìn)行分離，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.8 mL/min，每隔5 min收集一次(每管4 mL)。共收集180管，分別從每管中取200 μL收集液，使用苯酚硫酸法于490 nm下測其吸光度，繪制洗脫曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=14.229x-0.0001，r=0.999，見圖1，結(jié)果表明在0.02～0.1 mg范圍內(nèi)，葡萄糖的質(zhì)量與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 天麻鉤藤飲粗多糖提取條件優(yōu)化

2.2.1 料液比 由圖2知，隨著煎煮料液比增加，粗多糖質(zhì)量在料液比1∶15～1∶20之間增加，隨后降低。在1∶20時，粗多糖質(zhì)量最高，達(dá)10.65 g。

圖2 料液比對粗多糖質(zhì)量的影響

2.2.2 煎煮時間 由圖3可知，隨著煎煮時間的增加，粗多糖質(zhì)量先增加，煎煮40 min時粗多糖質(zhì)量最高，達(dá)10.95 g。當(dāng)煎煮時間為50 min時，粗多糖質(zhì)量明顯降低。

圖3 煎煮時間對粗多糖質(zhì)量的影響

2.2.3 煎煮次數(shù) 由圖4知，隨著煎煮次數(shù)的增加，粗多糖質(zhì)量先增加，煎煮4次時粗多糖質(zhì)量最高，達(dá)11.2 g，4次后粗多糖質(zhì)量減少。

圖4 煎煮次數(shù)對粗多糖質(zhì)量的影響

2.3 純化粗多糖(酶法去除蛋白質(zhì))

2.3.1 酶用量 由圖5可知，當(dāng)加入的木瓜蛋白酶量為0.8%時，蛋白質(zhì)的去除率最高，而多糖的剩余率也最高，故最佳酶用量為0.8%。

圖5 酶用量對酶法脫蛋白效果的影響

2.3.2 酶解時間 由圖6可知，當(dāng)酶解時間為60 min時蛋白質(zhì)的去除率略高于酶解50 min時的蛋白質(zhì)去除率，但在50 min時的多糖剩余率要略高于酶解時間為60 min時的多糖剩余率，研究時主要考慮減少多糖的損耗，綜合考慮，最佳酶解時間為40 min。

2.3.3 酶解溫度 由圖7可知，溫度差別對于多糖的損耗影響不大，而在50 ℃時蛋白質(zhì)的去除率最高，綜合考慮，最佳酶解溫度為50 ℃。

2.3.4 酶解pH 由圖8可知，pH對酶的影響較大，當(dāng)pH為中性時蛋白質(zhì)的去除率較高且多糖的損耗較小，綜合考慮，酶解最佳pH=7。

圖6 酶解時間對酶法脫蛋白的效果影響

圖7 酶解溫度對酶法脫蛋白效果的影響

圖8 pH對酶法脫蛋白效果的影響

2.4 多糖的分離

由圖9可知，吸光度在0.15以上的峰有9個，初步從粗多糖中分離得到9種不同組分。

圖9 SephadexG-100柱層析分離粗多糖洗脫曲線

3 討論

多糖是天麻鉤藤飲中多數(shù)藥物的主要成分之一，充分提取和純化多糖是開發(fā)利用天麻鉤藤飲的關(guān)鍵。本文通過單因素實(shí)驗(yàn)對天麻鉤藤飲中多糖的提取及分離純化進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝為煎煮4次，每次以1∶20的料液比煎煮40 min，此工藝下得到的粗多糖質(zhì)量最高。酶法去除蛋白質(zhì)的最佳工藝為加入0.8%的木瓜蛋白酶，pH=7，在50 ℃下反應(yīng)40 min，此工藝下蛋白質(zhì)的去除率最高，且多糖的損耗較少。本實(shí)驗(yàn)的煎煮液中總糖的含量為77.78%。對多糖的提取和純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，可保證在實(shí)驗(yàn)時得到最大量的粗多糖，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠的原料，避免成本的損耗。吸光度在0.15以上的峰有9個，初步從粗多糖中分離得到9種不同組分。本實(shí)驗(yàn)對復(fù)方中的多糖進(jìn)行了提取分離純化，為今后天麻鉤藤飲及天麻鉤藤飲中多糖成分的開發(fā)利用提供依據(jù)。