甘藍(lán)夜蛾信息素類似物的設(shè)計合成及初步活性研究

馬好運(yùn), 王安佳, 翁愛珍, 王留洋, 梅向東, 折冬梅, 寧 君

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

甘藍(lán)夜蛾(MamestrabrassicaeLinnaeus)隸屬于鱗翅目夜蛾科，具有群集性、夜出性和暴食性等特點(diǎn)，在我國西北、華北和東北等地區(qū)均有出現(xiàn)[1]。目前農(nóng)業(yè)仍依賴化學(xué)農(nóng)藥防治甘藍(lán)夜蛾，目前防治效果較好的化學(xué)藥劑有高效氯氟氰菊酯、溴除蟲菊酯、溴蟲腈和滅多威等[2]，但是對甘藍(lán)夜蛾綠色防治的研究報道較少?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長期使用，不僅會對人類健康和環(huán)境安全產(chǎn)生威脅，而且會導(dǎo)致害蟲的抗性問題越來越凸顯，因此迫切需開發(fā)和尋找綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的害蟲防控新技術(shù)。

昆蟲信息素是昆蟲個體與同物種其他成員間進(jìn)行通訊的化學(xué)信號[3]，絕大多數(shù)昆蟲利用這種化學(xué)信號進(jìn)行定位和特異性識別，從而完成交配和繁殖[4]。1978年Bestmann等[5]首次采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)鑒定出甘藍(lán)夜蛾信息素的主要成分為順-11-十六乙酸酯。Hiria等[6]確認(rèn)了順-11-十六乙酸酯為甘藍(lán)夜蛾的主要成分，并進(jìn)行了田間實(shí)驗(yàn)。Veire等[7]將未交配的雌蟲性腺的提取物進(jìn)行GC-MS分析后，發(fā)現(xiàn)有效成分為順-11-十六乙酸酯、順-11-十七乙酸酯和十六烷基乙酸酯質(zhì)量比為8/1/1，電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雄蟲對順-11-十六乙酸酯的響應(yīng)值較高。此后國外有關(guān)甘藍(lán)夜蛾信息素組分的鑒定時有報道，而國內(nèi)對甘藍(lán)夜蛾信息素的研究較少。與化學(xué)農(nóng)藥相比，昆蟲性信息素防治害蟲具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、微量高效、使用方便、環(huán)境友好、不誤傷天敵及價格低廉等特點(diǎn)。進(jìn)入21世紀(jì)以來，人們利用昆蟲信息素干擾交配治理害蟲的面積以幾何級的速度增加[8-9]。但天然的信息素易于降解、持效期短，長期單一使用某些性信息素組分可能導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗性等問題[10-11]，因此尋求穩(wěn)定高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的昆蟲性信息素替代物成為亟待解決的問題。

人工合成的(自然界中不存在)但結(jié)構(gòu)與天然性信息素組分相似的性信息素類似物，同樣能調(diào)節(jié)昆蟲的行為，繼而影響昆蟲化學(xué)通訊[12]。Burger等[13]對蘋果異形小卷蛾(Laspeyresiapomonella)的研究發(fā)現(xiàn)，將合成過程中的副產(chǎn)物7-乙烯基癸烷乙酸酯，添加到其性信息素組份(Z)-8-十二碳烯乙酸酯和(E)-8-十二碳烯乙酸酯中，可有效地干擾未交配雌蟲或性信息素誘芯對雄蟲的吸引。Carmen等[14]設(shè)計合成了一系列蛀莖夜蛾(Sesamianonagrioides)的鹵代烷酯性信息素類似物，在EAG試驗(yàn)中均能顯著降低雄蟲對性信息素的響應(yīng)值。將類似物與性信息素以質(zhì)量比1/10混合時，能顯著地干擾雄蟲對雌蟲性信息素的識別及定位。董夢雅等[15]以小菜蛾信息素(Z)-11-十六碳烯乙酸酯為母體結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成了多種性信息素類似物，并進(jìn)行了室內(nèi)活性測定，發(fā)現(xiàn)合成的信息素類似物能有效干擾雄蟲對誘芯的定位，對昆蟲的求偶過程產(chǎn)生迷向作用。陳展冊等[16]對9種綠盲蝽性信息素類似物進(jìn)行了活性驗(yàn)證。室內(nèi)觸角電生理反應(yīng)試驗(yàn)表明，綠盲蝽對其中的反-2-丁酸己烯酯EAG響應(yīng)值最高。Den等[16]通過單細(xì)胞記錄顯示，在順-11-十六乙酸酯中添加順-9-十四乙酸酯和順-11-十六醇，能影響使雄蟲產(chǎn)生逃避反應(yīng)的B類型感覺細(xì)胞的活性。

本文以此為基礎(chǔ)，根據(jù)甘藍(lán)夜蛾信息素的主要成分順-11-十六乙酸酯的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，對其進(jìn)行了兩種不同類型的結(jié)構(gòu)修飾。(1)極性基團(tuán)的修飾，即對甘藍(lán)夜蛾性信息素上的酯鍵進(jìn)行含氟或含溴基團(tuán)的取代。(2)碳鏈雙鍵的修飾，即將氟原子引入性信息素的碳鏈雙鍵上，使其成為含氟的飽和化合物。合成的4種類似物(G1～G4， Scheme 1～Scheme 2)的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR, GC-MS和HR-MS(ESI)等表征。采觸角電生理試驗(yàn)(EAG)初步測試了G1～G4的生物活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker DPX-300 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker solariX型質(zhì)譜儀；Syntech型觸角電位儀。

甘藍(lán)夜蛾成蟲采集于北京市延慶區(qū)舊縣鎮(zhèn)有機(jī)農(nóng)業(yè)示范園;羽化未交配成蟲來自于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，[飼養(yǎng)條件為：(25±3)℃，相對濕度(70±10)%，光周期16 h/8 h(L/D)]，將羽化的成蟲單獨(dú)置于指型管中，并用10%的紅糖水飼養(yǎng)備用;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)G1和G2的合成(以G1為例)

將反-11-十六碳烯-1-醇0.5 g溶于15 mL重蒸二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.01 g，三乙胺(TEA)0.32 g，于冰鹽浴中不斷攪拌，緩慢滴加3-氯丙酸酐0.32 g，滴畢，反應(yīng)2 h(TLC跟蹤)。用去離子水淬滅反應(yīng)，分液，有機(jī)相依次用飽和食鹽水(3×25 mL)洗滌，無水硫酸鎂干，過濾，有機(jī)相經(jīng)減壓蒸除溶劑，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/50]純化得目標(biāo)產(chǎn)物反-11-十六碳烯-3-氯丙酸酯(G1)。用類似的方法合成反-11-十六碳烯-2-溴丙酸酯(G2)。

Scheme 1

Scheme 2

G1： 淡黃色油狀液體，收率63%；1H NMRδ: 0.90(t,J=6.92 Hz, 3H), 1.30(m, 18H), 1.64(m, 2H), 2.01(m, 4H), 2.79(t,J=6.72 Hz, 2H), 3.76(t,J=6.72 Hz, 2H), 4.12(t,J=6.72 Hz, 2H), 5.36(m, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 14.0, 22.7～22.9(2C), 25.2～25.6(3C), 29.9～30.0(7C), 32.6, 52.5, 68.5, 129.8～130.3(2C), 158.4； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H35O2ClNa{[M+Na]+}339.206678, found 339.206871。

G2： 黃色油狀液體，收率44%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.89(t,J=8.48 Hz, 3H), 1.30(m, 18H), 1.67(m, 2H), 1.82(d,J=6.72 Hz, 2H), 2.00(m, 4H), 4.16(t,J=9.11 Hz, 2H), 4.37(m, 1H), 5.35(m, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 13.9, 21.7～22.3(2C), 25.7, 29.1～29.7(7C), 31.8～32.6(3C), 40.2, 66.1, 68.5, 129.8～130.3(2C), 170.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H35O2BrNa{[M+Na]+}397.171809, found 397.171547。

(2)G3和G4的合成

將催化劑3,5-二(2-甲氧基-2-氧乙氧基)-4-碘苯甲酸甲酯0.02 g，間氯過氧苯甲酸(mCPBA)0.45 g和無水二氯甲烷50 mL加入聚乙烯平底燒瓶中，通入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，加入順-11-十六碳烯-1-醇0.5 g。用注射器吸取70%吡啶氫氟酸鹽2.5 g，緩慢加入反應(yīng)體系中，攪拌下反應(yīng)12 h(TLC檢測)。放入低溫槽中，于-78 ℃分批加入堿性氧化鋁15 g，加畢，反應(yīng)0.5 h。緩慢升至室溫，過濾，濾液依次用飽和Na2SO3溶液洗滌除去m-CPBA，用飽和食鹽水(3×25 mL)洗滌除去水溶性雜質(zhì)，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/6]純化得11,12-二氟十六烷基-1-醇(G3)。用類似的方法合成11,12-二氟十六烷基乙酸酯(G4)。

G3： 淡黃色油狀液體，收率30%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.92(t,J=11.88 Hz, 3H), 1.49(m, 24H), 3.59(m, 2H), 4.32(s, 1H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 14.0, 22.7～22.8(2C), 25.0～25.6(4C), 29.6～30.3(5C), 33.2, 62.8, 96.0(2C), 170.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H32OF2Na{[M+Na]+}301.231886, found 301.231458。

G4： 淡黃色油狀液體，收率26%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.92(t,J=13.78 Hz, 3H), 1.52(m, 24H), 2.17(s, 3H), 4.05(t,J=13.50 Hz, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 13.9, 20.9, 22.5～22.6(2C), 25.0～25.8(4C), 29.6～31.2(6C), 64.6, 95.4, 97.6, 171.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C18H36O2F2Na{[M+Na]+}343.242457, found 343.242618。

1.3 室內(nèi)生物活性測試

準(zhǔn)確稱取4種類似物分別溶于色譜純正己烷中，配置成0.1 μg/μL、 1 μg/μL、 10 μg/μL、 100 μg/μL的待測溶液。并將不同濃度的信息素類似物組分均勻地涂抹在對折過的濾紙條上(長6 cm，寬1 cm)，待測溶劑揮發(fā)后將濾紙放入巴斯德管(長22.5 cm，內(nèi)徑6 mm)，以分析純的正己烷作為對照，為保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，含有信息素類似物的濾紙條需現(xiàn)配現(xiàn)用。

將指型管中羽化2～3 d的甘藍(lán)夜蛾成蟲進(jìn)行分類，從中挑選出健康的雄性甘藍(lán)夜蛾進(jìn)行EAG實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前黑暗處理2 h，以模擬田間自然條件[17]。在顯微鏡下將雄蟲的觸角完整取出，然后用刀片將觸角的尖端末尾切下。切好的觸角通過裝有0.1 M氯化鉀溶液的玻璃電極連接在探頭上，組成閉合回路。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每頭昆蟲用一根觸角，每個類似物的不同濃度做3個重復(fù)。對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0分析軟件，顯著差異性分析利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

(1)對甘藍(lán)夜蛾信息素極性基團(tuán)的修飾，由于溴原子的空間位阻較大，且氯原子的供電子效應(yīng)大于溴原子，因此含氯的類似物的收率高于含溴的類似物，且反應(yīng)速度較快。(2)對甘藍(lán)夜蛾信息素碳鏈雙鍵的修飾，反應(yīng)在丙酮和液氮控制的-78 ℃條件下，保證了反應(yīng)體系中多余酸的緩慢中和，減少了副產(chǎn)物的發(fā)生。在進(jìn)行柱層析過程中，由于類似物G3、G4的極性較小，在選擇展開劑時，當(dāng)展開劑為乙酸乙酯/石油醚=1/30或1/20時，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)不能完全分離，當(dāng)展開劑為乙酸乙酯/石油醚=1/10時，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)基本分離，經(jīng)過進(jìn)一步的篩選，最終確定最佳的展開劑為乙酸乙酯/石油醚=1/6。此外，添加催化劑3,5-二(2-甲氧基-2-氧乙氧基)-4-碘苯甲酸甲酯能大幅度的提高反應(yīng)速率。

楊新玲等[18]用AccuModel和PowerFit軟件比較了蚜蟲報警信息素EBF的氟取代類似物與EBF的結(jié)構(gòu)相似性，并對非EBF系列物結(jié)構(gòu)活性關(guān)系進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)一氟取代化合物與EBF的結(jié)構(gòu)相似，并推測一氟類似物可能有較好的活性。本文合成的含氟甘藍(lán)夜蛾信息素類似物，氟原子與氫原子結(jié)構(gòu)相似，能夠準(zhǔn)確的定位于昆蟲性信息素受體位點(diǎn)，同時氟原子電負(fù)性較強(qiáng)，使得類似物分子具有極性和非極性的雙重特性；使得類似物在通過昆蟲磷脂雙分子層時，能更有效地被昆蟲嗅覺受體識別以及轉(zhuǎn)化為電位信號進(jìn)行傳導(dǎo)[19]，因而推測含氟的甘藍(lán)夜蛾性信息素類似物有較好的田間生物活性。

2.2 表征

以G4為例，分析了目標(biāo)產(chǎn)物的1H NMR譜圖。受羰基吸電子基團(tuán)的影響，與羰基相連的末端CH3上氫的化學(xué)位移向低場移動，δ2.12附近表現(xiàn)為單峰。受氧原子電子云誘導(dǎo)效應(yīng)的影響，與氧相連的亞甲基CH2的氫化學(xué)位移向低場移動，同時受臨近碳原子上氫的耦合作用的影響，表現(xiàn)為三重峰，特征峰位于δ4.08附近?；衔锬┒薈H3上的氫，受臨近碳原子上氫原子的耦合作用影響，表現(xiàn)為三重峰，特征峰位于δ0.90附近。由于氟原子的電負(fù)性最大，與氟相連的兩個碳原子上的氫受氟原子電負(fù)性的影響，化學(xué)位移向低場移動，特征峰位于δ3.62和δ4.38附近。其他24個氫原子的化學(xué)位移則在高場δ1.49附近。

δ圖1化合物G4的1H NMR譜圖

2.3 EAG活性

本文對4種類似物進(jìn)行了雄蟲觸角電生理反應(yīng)，結(jié)果見表1。由表1可見，甘藍(lán)夜蛾對合成的4種結(jié)構(gòu)新穎的類似物均有響應(yīng)值，但響應(yīng)值較小，在低濃度時與空白差異無顯著性，但隨著化合物濃度的增大，響應(yīng)值也不斷增加，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果對田間實(shí)驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)作用。

表1 甘藍(lán)信息素類似物直接刺激EAG活性*

本文設(shè)計合成4種結(jié)構(gòu)新穎的甘藍(lán)夜蛾信息素類似物，受空間位阻和電負(fù)性的影響，在合成G1、G2的反應(yīng)中，含氯的類似物的反應(yīng)速率大于含溴的類似物。在合成G3、G4的反應(yīng)中，以丙酮和液氮為冷卻介質(zhì)，將反應(yīng)溫度控制在-78 ℃左右，減少了副產(chǎn)物地發(fā)生。為保證反應(yīng)完全，加入過量的氫氟酸，反應(yīng)完全后用堿性氧化鋁除去多余的酸。室內(nèi)活性測定表明甘藍(lán)夜蛾對4種類似物均有一定的響應(yīng)，且隨著所用類似物濃度的增大，響應(yīng)值也不斷增加，但這些類似物是否具有較好的田間生物活性，有待于進(jìn)一步研究?？梢姡ハx信息素類似物對昆蟲交配行為的干擾和抑制是一種合理的行為控制方法，能夠有效解決天然信息素田間易降解、持效期短等問題，為甘藍(lán)夜蛾的綜合防治提供了新思路。