新型齊墩果酸糖苷化衍生物的合成及體外抗HCT8活性

鄧代艷, 王歡, 張勇民, 李軍, 董登祥*

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 55002; 2. 貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550018; 3. 法國索邦大學(xué) 法國國家科研中心，巴黎 75005)

齊墩果酸(Chart 1)又名慶四素，是齊墩果烷型中的五環(huán)三萜類化合物，一般為白色粉末，大多以糖苷或游離形式存在于植物中[1]，如青龍衣[2]、白花蛇舌草、山楂、丁香、大棗、女貞子、枇杷葉及夏枯草等。齊墩果酸具有多種藥理活性，如保肝、抗腫瘤、降糖、抗HIV、抗?jié)?、增?qiáng)免疫等[3-8]，目前，臨床上主要以齊墩果酸口服制劑治療急慢性肝炎，尤其是急性黃疸型和慢性中毒型肝炎，或者抗癌輔助藥物[9]。惡性腫瘤疾病患者口服齊墩果酸后，吞噬細(xì)胞百分比例顯著上升，吞噬指數(shù)也有所提高，且體內(nèi)主要器官無明顯損傷。

Chart 1

目前，齊墩果酸在臨床上運(yùn)用的制劑品種單一，并且水溶性較差，導(dǎo)致生物利用度不理想。為改善齊墩果酸衍生物的活性和生物利用度，研究人員進(jìn)行了多方面努力[10-11]。唐初等[12]將C-28位羧基轉(zhuǎn)化成酯或酰胺，得到的齊墩果酸衍生物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。王京等[13]以多種類型的基團(tuán)作為鏈段，使羥基與硝酸酯類NO供體偶聯(lián)，合成的齊墩果酸衍生物對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)HT-29以及人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制活性均較強(qiáng)。Yoshikawa等[14]研究了齊墩果酸連不同糖基對(duì)降糖活性的影響。發(fā)現(xiàn)不能在C-28位羧基形成糖苷鍵，而C-3位羥基形成糖苷鍵能增強(qiáng)活性。

天然產(chǎn)物通過糖基化反應(yīng)形成的糖苷類化合物，可提高天然產(chǎn)物的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度[15-17]。此外，糖鏈與三萜類化合物的生物活性關(guān)系密切，改變糖鏈可能對(duì)皂苷的活性產(chǎn)生較大影響[18-21]。王歡等[22]通過糖苷化對(duì)常春藤進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，顯著提高了常春藤的水溶性，同時(shí)增強(qiáng)了其體外抗膀胱癌細(xì)胞的活性。

本文在此基礎(chǔ)上，以齊墩果酸苷元為起始原料，對(duì)其28-COOH進(jìn)行甲基化修飾后制得齊墩果酸-28-羧甲酯(1)。分別以D-半乳糖、D-葡萄糖、D-氨基葡萄糖為起始原料，通過對(duì)糖羥基的保護(hù)與去保護(hù)，得到一系列的二糖、四糖片段。通過三氯乙酰亞胺酸酯途徑和對(duì)甲苯硫基途徑，利用合成的糖片段對(duì)1的3-位羥基進(jìn)行糖化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，合成了4種新型的齊墩果酸糖苷化衍生物(2～5, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和MS(ESI)表征。采用MTT法測(cè)試了2～5對(duì)高表達(dá)人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT8)的體外抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WFH-203B型三用紫外分析儀；INOVA-400/500 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；FINNI ANLACQ-DECA型質(zhì)譜儀。

D-半乳糖、D-葡萄糖、D-氨基葡萄糖、α-乳糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸對(duì)照品，純度≥99%，南京源植生物科技有限公司；2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-乙?；?D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(a), 對(duì)甲基-苯基-S-(2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-3,4,6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-6-O-芐基-2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-3-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷(c), 對(duì)甲基-苯基-S-(2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-6-O-芐基-3-O-乙酰基-2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-β-D-吡喃葡萄糖苷(e), 對(duì)甲基-苯基-S-[(2,3,4,6-四-O-乙?；?D-半乳糖基)-(1→4)-2,3,6-三-O-乙?；?D-葡萄糖基-(1→4)-2,6-二-O-芐基-D-半乳糖基]-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-D-葡萄糖苷(j)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)1的合成[12]

稱取OA 1.0 g加入500 mL圓底燒瓶中，加入MeI 2 mL,四丁基氟化銨(TBAF)500 mg, 5%NaHCO3溶液80 mL和DCM 40 mL，通入氮?dú)?，攪拌下反?yīng)4 h(TLC檢測(cè),展開劑:A=Cy/EtOAc=3/2,V/V)。用DCM/H2O萃取，有機(jī)相用無水MgSO4干燥，過濾，收集濾液，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1/1)純化得白色固體粉末11.03 mg，收率 98.6%, m.p.156～158 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 5.28(m,J=2.8 Hz, 1H, 12-H), 3.63(s, 3H, OCH3), 3.21(m, 1H, 3-H), 2.86(dd,J=14.0 Hz, 4.8 Hz, 1H, 18-H), 1.97(s, H, 11-H), 1.75(m, 2H, 22-H), 1.65(m, 2H, 16-H), 1.59(m, 2H, 2-H),1.48(s, H, 9-H), 1.40(m, 2H, 6-H), 1.39(m, 6H, 1,5,7-H), 1.36(m, 4H, 19,21-H), 1.25(m, 2H, 15-H), 1.12(s, 3H, 27-H), 0.99(s, 3H, 26-H), 0.96(s, 3H, 30-H), 0.93(s, 3H, 23-H), 0.90(s, 3H, 24-H), 0.77(s, 3H, 29-H), 0.72(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 178.3(C28), 143.7(C13), 122.3(C12), 79.0(C3), 55.2(OMe), 51.5(C9), 47.6(C5), 46.7(C17), 45.8(C19), 41.6(C4), 41.3(C14), 39.2(C18), 38.7(C8), 37.0(C10), 33.8 (C21), 33.1(C29), 32.6(C22), 32.3(C7), 30.6(C20), 28.1(C15), 26.9(C27), 25.9(C2), 23.6(C11), 23.3(C30), 23.0(C16), 17.7(C6), 18.3(C26), 16.8(C25), 15.6(C23), 15.2(C24); MS(ESI)m/z: 493.2{[M+Na]+}。

Scheme 1

(2)2的合成

稱取化合物a198 mg(0.25 mmol)和1100 mg(0.21 mmol)加入50 mL干燥圓底燒瓶中，加入4? 分子篩100 mg，抽真空，通入氮?dú)猓尤霟o水DCM約7 mL，攪拌使其充分溶解；將反應(yīng)體系置于冰鹽浴條件下攪拌，平衡10 min后加入BF3Et2O 18 μL，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè)，展開劑：A=5/4)。加入幾滴TEA終止反應(yīng)，用DCM/H2O萃取，有機(jī)相用無水MgSO4干燥，過濾，收集濾液，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑為Cy/EtOAc=3/1)純化，濃縮得化合物b45 mg，收率20.3%。

稱取化合物b26 mg(0.05 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入MeOH約4 mL，攪拌使其溶解；緩慢加入新制MeONa溶液，調(diào)pH至12～13，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè)，展開劑A=1/2)。加入陽離子交換樹脂調(diào)pH至弱酸性，濾去樹脂，減壓濃縮除去甲醇，真空干燥得粗產(chǎn)物，用HL-20凝膠柱純化(洗脫劑:MeOH)純化，濃縮得白色粉末齊墩果酸-28-羧甲酯-3-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)β-D-吡喃葡萄糖(2)20 mg，收率94.1%, m.p.24 ～248 ℃;1H NMR(CD3OD, 500 Hz)δ: 5.23(brt,J=3.4 Hz, 1H, 12-H), 4.36 (d,J=7.6 Hz, 1H, 1″-H Lac), 4.28(d,J=7.9 Hz, 1H, 1′-H Lac), 3.89(dd,J=11.9 Hz, 2.5 Hz, 1H, 6″-H Lac), 3.82(s, 1H, 2″-H Lac), 3.76(dd,J=11.5 Hz, 3.9 Hz, 1H, 6″-H Lac), 3.75(s, 3H, 5″-H Lac, 3″-H Lac), 3.68(s, 1H, 4″-H Lac), 3.60(s, 3H, OCH3), 3.58(m, 2H, 3′-H Lac), 3.57(dd,J=11.9 Hz, 3.3 Hz, 1H, 3-H), 3.53(dd,J=7.6 Hz, 2.1 Hz, 1H, 5′-H Lac), 3.47(t,J=9.7 Hz, 1H, 6′-H Lac), 3.38(m,J=9.4 Hz, 1H, 4′-H Lac), 3.27(t,J=8.9 Hz, 1H, 2′-H Lac), 2.85(dd,J=13.7 Hz, 4.3Hz, 1H, 18-H), 2.06(s, 2H, 11-H), 1.86(s, 2H, 22-H), 1.61(s, 2H, 16-H), 1.59(s, 2H, 2-H), 1.48(s, 2H, 9-H),1.40(s, 2H, 6-H), 1.36(s, 2H, 5-H), 1.32(s, 8H, 21-H, 19-H, 1-H, 7-H), 1.13(s, 3H, 27-H), 0.95(s, 3H, 30-H), 0.90(s, 6H, 29-H, 23-H), 0.72(s, 3H, 26-H), 0.69(s, 3H, 24-H);13C NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 180.0(C28), 144.9(C13), 123.9(C12), 106.6(C1′Lac), 105.0(C3), 90.9(C5′Lac), 80.7(C5″Lac), 77.0(C2′Lac), 76.5(C4′Lac), 76.2(C6′Lac), 75.7(C5′Lac), 75.4(C3″Lac), 74.7(C2″Lac), 73.5 (C4″Lac), 72.5(C6″Lac), 57.0(OMe), 52.2(C9), 49.5(C5), 48.1(C17), 47.0(C19), 42.8(C4), 40.6(C14), 40.1 (C18), 39.7(C8), 37.8(C1), 36.4(C10), 34.7(C21), 33.9(C29), 33.7(C22), 33.5(C7), 31.7(C20), 27.2(C15), 26.9(C27), 25.9(C2), 24.5(C11), 24.2(C30), 23.9(C16), 18.9(C6), 17.6(C26), 17.2(C25), 16.9(C23), 15.9 (C24); MS(ESI)m/z: 817.3{[M+Na]+}。

(3)3的合成

稱取c50 mg (0.05 mmol)、150 mg(0.10 mmol)、 NIS 15 mg(0.08 mmol)和4?分子篩50 mg加入25 mL干燥圓底燒瓶中，抽真空，通入氮?dú)?，加入適量DCM，攪拌使其溶解；于0 ℃平衡10 min后加入TfOH 5 μL(0.02 mmol)，攪拌下反應(yīng)1 h(TLC檢測(cè)，展開劑：A=1/1)。加入飽和NaHCO3和飽和Na2S2O3淬滅反應(yīng)，用DCM/H2O萃取，有機(jī)相層用無水MgSO4干燥，過濾，收集濾液，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2/1)純化得白色固體d22 mg，收率32.0%。

稱取d10 mg(0.04 mmol)加入25 mL圓底燒瓶中，加入Ac2O 2 mL(0.02 mol)和MeOH 2 mL，通入氮?dú)?，攪拌下反?yīng)24 h(TLC檢測(cè),展開劑:B=DCM/MeOH=8/1,V/V)。加入適量Tol，減壓蒸除溶劑，殘余物用MeOH溶解，過濾，收集濾液，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：B)純化，再用HL-20(洗脫劑:MeOH)純化得白色固體齊墩果酸-28-羧甲酯-3-O-(2-去氧-2-N-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-6-O-芐基-2-去氧-2-N-乙?；?β-D-吡喃葡萄基(3)8 mg，收率74.2%, m.p.293～296 ℃;1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 7.25～7.35(m, 5H, Ar-H), 5.48(d,J=8.2 Hz, 1H, 1-H Glu), 5.25(brt,J=2.8 Hz, 1H, 12-H), 4.87(m, 1H, 3-H), 3.41～4.45(m, 15H, Bn-CH2, Glu-H, Gal-H), 3.60(s, 3H, OCH3), 3.31(s, 6H, NCH3), 3.07(d,J=9.4 Hz, 1H, 23-H), 2.85(dd,J=14.0 Hz, 4.8 Hz, 1H, 18-H), 2.04(s, 2H, 11-H), 1.79(s, 2H, 22-H), 1.68(s, 2H, 2-H), 1.60(s, 2H, 16-H), 1.52(s, 2H, 6-H), 1.36(s, 4H, 7-H, 1-H), 1.30～1.34(s, 5H, 5-H, 19-H, 21-H), 1.14(s, 3H, 27-H), 0.94(s, 3H, 26-H), 0.93(s, 3H, 30-H), 0.92(s, 3H, 24-H), 0.90(s, 3H, 24-H), 0.76(s, 3H, 29-H), 0.73(s, 3H, 25-H);13C NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 179.4(C28), 171.6(2C, NHCOCH3), 150.8(C13), 137.2(C1Ar), 128.6～129.4(5C, C2-6Ar), 125.9(C12), 106.7(C1′Glu-N), 105.6(C1″Glu-N′), 79.6(Bn-CH2), 78.72(C3), 75.83(C2″), 74.14(C3′), 73.02(C3′) 72.66(C3″), 72.10(C4′), 70.26(C4″), 67.55(C6″), 56.38(C23), 52.75(C5′), 51.76(C5″), 50.04(OMe), 49.3(C5), 48.9(C17), 45.4(C14), 40.8(C19),37.7(C4), 35.6(C2), 34.4(C21), 32.4(C18), 31.2(C15), 30.0(C30,C29), 29.9(C7), 29.5(C16), 26.5(C22), 26.3(C11), 25.6(C27), 24.8(C20), 20.9(2C, NHCOCH3), 18.6(C6), 17.3(C24), 16.8(C26); MS(ESI)m/z: 905.3{[M+Na]+}。

(4)4的合成

稱取化合物e150 mg(0.17 mmol)和1150 mg(0.31 mmol)加入50 mL干燥圓底燒瓶中，加入NIS 60 mg和4?分子篩100 mg，抽真空，通入氮?dú)?，加入無水DCM約8 mL，攪拌使其充分溶解；冰鹽浴冷卻，平衡10 min后加入TfOH 8 μL(0.02 mmol)，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè)，展開劑：A=3/2)。加入飽和NaS2O3溶液中和過量NIS，反應(yīng)體系由紅色變?yōu)闊o色，再加入飽和NaHCO3溶液中和過量TfOH，用DCM/H2O萃取，有機(jī)相用無水MgSO4干燥，過濾，收集濾液，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=3/1)純化，濃縮得化合物f130 mg，收率62.5%。

將f置于干燥圓底燒瓶中，加入Ac2O 2 mL(0.02 mol)和MeOH 2 mL，通入氮?dú)?，攪拌下反?yīng)24 h(TLC檢測(cè),展開劑:B=10/1)。加入適量Tol，減壓蒸除溶劑，殘余物用MeOH溶解，過濾，收集濾液，減壓蒸除溶劑，粗品經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：B=8/1)純化，再用HL-20(洗脫劑:MeOH)純化得白色固體齊墩果酸-28-羧甲酯-3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-6-O-芐基-2-去氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基(4)25 mg，收率68%， m.p.274～277 ℃;1H NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 7.22～7.25(m, 5H, Ar-H), 5.43(d,J=8.2 Hz, 1H, 1-HGlu), 5.21(brt,J=2.8 Hz, 1H, 12-H), 4.91 (m, 1H, 3-H), 4.67(m, 2H, Bn-CH2), 4.66(s, 1H, 1″-H), 4.49(s, 1H, 2′-H), 4.24(s, 1H, 3′-H), 3.86(s, 1H, 2″-H), 3.77(s, 1H, 5″-H), 3.65(s, 1H, 5′-H), 3.50(s, 2H, 6″-H), 3.49～3.55(m, 3H, 3″-H, 4″-H, 4′-H), 3.53(s, 3H, OCH3), 3.32(s, 3H, NCH3), 2.92(d,J=9.4 Hz, 1H, 23-H), 2.84(d,J=14, 1H, 4.8 Hz, 18-H), 1.92(s, 2H, 22-H), 1.85(s, 2H, 22-H), 1.68(s, 2H, 16-H), 1.59(s, 2H, 2-H), 1.53(s, 1H, 9-H), 1.46(s, 2H, 6-H), 1.39(s, 1H, 5-H), 1.28(s, 8H, 1-H, 7-H, 19-H, 21-H), 1.14(s, 3H, 27-H), 0.96(s, 3H, 26-H), 0.92(s, 3H, 30-H), 0.90(s, 3H, 23-H), 0.89(s, 3H, 24-H), 0.69(s, 6H, 29-H, 25-H); MS(ESI)m/z: 948.5{[M+Na]+}。

(5)5的合成

稱取化合物j60 mg(0.08 mmol)、150 mg(0.10 mmol)、 NIS 30 mg(0.12 mmol)和4? 分子篩50 mg加入25 mL干燥圓底燒瓶中，抽真空，通入氮?dú)猓尤隓CM溶解；于0 ℃冰浴平衡10 min，加入TfOH 2μL(0.02 mmol)，攪拌下反應(yīng)2 h(TLC檢測(cè),展開劑:A=1/1)。加入飽和NaHCO3和飽和Na2S2O3淬滅反應(yīng),用DCM/H2O萃取，有機(jī)相用無水MgSO4干燥，過濾，收集濾液，減壓蒸除溶劑得粗品，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2/1)純化得白色固體齊墩果酸-28-羧甲酯-3-O-[β-D-吡喃半乳糖基- (1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,6-二-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基(5)20 mg，收率26.8%; m.p.320～322 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.15～7.23(m, 25H, Ar-H), 5.31 (d,J=8.3 Hz, 1H, 1-H Lac), 5.27(brt,J=2.8 Hz, 1H, 12-H), 5.14(m, 1H, 3-H), 5.14(d,J=7.8 Hz, 2H, 1″″-H, 1?-H),5.06(s, 1H, 3″″-H), 4.99(s, 1H, 5″″-H), 4.88(s, 1H, 2″″-H), 4.75(s, 8H, Bn-CH2), 4.65(s, 1H, 4″″-H), 4.51(s, 1H, 2?-H), 3.60(s, 1H, 3″-H, 3′-H), 4.43(s, 1H, 5?-H), 4.39(s, 1H, 3?-H), 4.35(s, 2H, 6?-H), 4.31(s, 2H, 6″″-H), 4.24(s, 2H, 2″-H, 2′-H), 4.13(s, 2H, 6″-H, 6′-H), 4.04(s, 1H, 23-H), 3.79(s, 1H, 5′-H), 3.61(s, 3H, OCH3), 3.53(s, 1H, 5″-H), 3.50(s, 1H, 4?-H), 3.28(s, 1H, 4″-H), 3.26(s, 1H, 4′-H), 2.03(s, 24H, 8×OAc), 3.19(s, 1H, 3-H), 2.82(d,J=14.8 Hz, 18-H), 1.80(s, 2H, 11-H), 1.68(s, 2H, 22-H), 1.62(s, 2H, 16-H), 1.58(s, 2H, 2-H), 1.40(s, 2H, 6-H), 1.37(s, 1H, 9-H), 1.35(s, 2H, 19-H), 1.32(s, 1H, 5-H), 1.26(s, 2H, 21-H), 1.25(s, 2H, 1-H), 1.24(s, 2H, 7-H), 1.17(s, 2H, 15-H), 1.16(s, 3H, 27-H), 0.97(s, 3H, 26-H), 0.93(s, 3H, 30-H), 0.90 (s, 3H, 23-H), 0.87(s, 3H, 24-H), 0.72(s, 6H, H-29, H-25);13C NMRδ: 178(C28), 152.98(C13), 126.67～128.45(24C, Ar), 129.78(C12), 101.80(C1'), 98.64(C1″), 97.76(C1?), 96.69(C1″″), 80.16(C3), 78.00～78.10(4C, Bn-CH2), 77.05(C5'), 72.93(C5″), 75.36(C5?), 74.18(C5″″), 72.00～72.10(4C, C3″″, C3?, C3″, C3′),69.20～67.89(4C, C2″″, C2?, C2″, C2′), 67.20～67.89(2C, C6?, C6′, C6″, C6′), 65.40 ～ 76.87(4C, C4″″, C4?, C4″, C4′), 56.38(OMe), 50.82(C23), 49.41(C5), 47.34(C9), 46.83(C17), 44.75(C14), 40.65(C19), 40.20(C8), 39.63(C21), 34.92(C4), 33.54(C15), 32.43(C18), 30.65(C10), 29.82(C1), 28.82(C30), 28.47(C29), 26.57(C2), 23.97(C11), 24.70(C22), 23.54(C20), 37.47(C7), 21.52(C27), 21.97(C25), 20.63(C16), 18.45(C6), 16.59(C26), 16.24(C24); MS(ESI)m/z: 1607.7{[M+Na]+}。

1.3 生物活性測(cè)試

取對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HCT8細(xì)胞，以3×105個(gè)/mL 的細(xì)胞濃度,每孔按100 μL細(xì)胞懸液隨機(jī)平行接種到96孔板內(nèi)，孵育24 h后，接種藥物。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組，包括空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組；其中空白培養(yǎng)基對(duì)照組為HCT8培養(yǎng)基由90%F～12 K 無血清培養(yǎng)液和10%胎牛血清現(xiàn)配而成，正常細(xì)胞組為正常培養(yǎng)細(xì)胞，以阿霉素為陽性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為化合物2～5。在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)后，加入含有不同藥物濃度(濃度分別為1×10-3mmol/L, 1×10-4mmol/L, 1×10-5mmol/L, 1×10-6mmol/L)的新鮮培養(yǎng)基。每組6個(gè)復(fù)孔，分別孵育24 h后，每孔加人10 μL MTT溶液(濃度為5 mg/mL)，在5%CO2的恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育4 h。吸去上清液，每孔加入200 μLDMSO溶液，振蕩10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長570 nm處的吸光度值，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

2～5的合成采用了三氯乙酰亞胺酸酯和對(duì)甲苯硫基兩種路線，其中亞胺脂合成法的收率較高，但亞胺脂基團(tuán)容易失活，主要原因在于合成三氯乙酰亞胺酸酯時(shí),1-位的半縮醛-OH被CNCCl3保護(hù)后，對(duì)質(zhì)子酸較敏感，得到的產(chǎn)物穩(wěn)定性差。

在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，我們多次嘗試脫去齊墩果酸C-28-位上的甲基，如20%NaOH、 30%NaOH、 50%NaOH堿性條件，加熱條件，均未成功。用不同濃度KOH和酯交換嘗試，效果也不太理想。

2.2 抑制活性

表1為目標(biāo)化合物對(duì)HCT8的體外抑制活性。由表1可見，齊墩果酸經(jīng)C-28位甲酯化和C-3位連接二糖和四糖后得到的衍生物(2～4)在不同濃度下對(duì)HCT8均具有抑制活性。其中化合物5在最高濃度1×10-3mmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到(98.96±0.10)%。

表 1 目標(biāo)化合物對(duì)HCT8的體外抑制率

合成了4種新型的齊墩果酸糖苷化衍生物(2～5)，并采用MTT法初步評(píng)價(jià)了化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的體外抑制活性。雖然化合物的抑制活性略低于阿霉素，但也為今后齊墩果酸及其衍生藥物的開發(fā)與應(yīng)用提供借鑒。對(duì)于天然化合物中具有良好活性的化合物，但水溶性差的物質(zhì)，可考慮用糖片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾，解決水溶性差的難題。