益腎健脾利濕方對(duì)乙硫氨酸誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠的保護(hù)作用

李先行，杜昊炎

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.商丘市中醫(yī)院，河南 商丘 476000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素外所導(dǎo)致的肝病，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征[1-3]，是一種全身性代謝綜合征。除肝脂肪變性外，NAFLD患者無其他明顯的臨床癥狀，但具有發(fā)展為非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化、肝硬化、肝功能衰竭及肝細(xì)胞癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。目前導(dǎo)致NAFLD脂質(zhì)代謝異常的相關(guān)機(jī)制尚未明確，但其發(fā)生與心腦血管疾病、中心性肥胖、糖尿病及脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)[7]，臨床上暫無特異有效的治療方法。目前NAFLD的治療藥物以減肥降脂藥、胰島素抵抗藥和護(hù)肝藥為主，不良反應(yīng)較多[8]，而中醫(yī)藥治療NAFLD因治法完備、不良反應(yīng)少，越來越受到廣泛關(guān)注。益腎健脾利濕方由茵陳蒿湯、六味地黃丸加參苓白術(shù)散組成，具有清熱利濕、補(bǔ)益肝腎之功效。本實(shí)驗(yàn)以昆明種小鼠為對(duì)象，探討益腎健脾利濕方對(duì)乙硫氨酸誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為益腎健脾利濕方對(duì)NAFLD的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)昆明種小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004，根據(jù)隨機(jī)分組法分為4組，分別為正常對(duì)照組、脂肪肝模型組、益腎健脾利濕方組和二甲雙胍組，每組10只，所有小鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由采食飲水。

1.2 主要儀器

HC-2064型高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋(余姚布亞星儀器儀表有限公司)；XH-D型渦旋混勻器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；MULTISKAN FC型酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司)；723型可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；BSA224S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

DL-乙硫氨酸(上海麥克林生化科技有限公司)；鹽酸二甲雙胍片(上海上藥信誼藥廠有限公司)；總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)所用中藥材均購自鄭州市張仲景大藥房。

1.4 脂肪肝模型的建立

40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，脂肪肝模型組、益腎健脾利濕方組和二甲雙胍組小鼠灌胃DL-乙硫氨酸250 mg/kg(2.5%的溶液給藥體積為10 mL/kg)，1次/d，連續(xù)7 d，制備非酒精性脂肪肝模型，正常對(duì)照組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

1.5 中藥制備及給藥

益腎健脾利濕方組方：茵陳30 g,大黃9 g,梔子9 g,柴胡15 g,白術(shù)10 g,丹參30 g,山藥12 g,茯苓9 g,澤瀉9 g,熟地黃15 g,枸杞子9 g,淫羊藿9 g,雞血藤15 g,甘草6 g和大棗6枚。濃縮成1 g生藥/mL的溶液備用。中藥給藥劑量根據(jù)公式S小鼠/20 g=0.002 6×S人/70 kg，得出益腎健脾利濕方給藥劑量(口服劑量)為小鼠0.486 2 g/20 g(人為187 g/70 kg)，即灌胃劑量為24.31 g/kg/小鼠。因此益腎健脾利濕方組小鼠按24.31 g/kg(含生藥1 g/mL)劑量灌胃益腎健脾利濕方水煎液，2次/d，連續(xù)14 d。

二甲雙胍組小鼠按劑量150 mg/kg(0.62%的二甲雙胍給藥體積為24.31 mL/ kg)灌胃二甲雙胍，2次/d，連續(xù)14 d。

按照等量不等濃度的原則，正常對(duì)照組和脂肪肝模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 血清中TC、TG、ALT、AST含量測(cè)定

各組小鼠均在末次給藥6 h后摘取眼球取血，3 000 r/min離心20 min，取血清，用試劑盒測(cè)定各組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG含量，測(cè)試步驟按說明書進(jìn)行。

1.6.2 肝臟系數(shù)測(cè)定

末次給藥后，各組小鼠頸椎脫臼處死，解剖取肝臟，稱重，按照下列公式計(jì)算肝臟系數(shù)。

肝臟系數(shù)(%)=肝臟濕重/小鼠體質(zhì)量×100%

1.6.3 肝臟勻漿中TC、TG含量測(cè)定

取“1.6.2”項(xiàng)下小鼠肝臟相同部位的肝組織100 mg，以2 mL丙酮—乙醇混合液(1∶1)研磨制備勻漿，抽提脂質(zhì)，離心取上清液，用試劑盒測(cè)定肝臟中TC、TG含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟系數(shù)測(cè)定結(jié)果

脂肪肝模型組小鼠肝臟系數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)；益腎健脾利濕方組和二甲雙胍組小鼠肝臟系數(shù)顯著低于脂肪肝模型組(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠肝臟系數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與脂肪肝模型組比較，bP<0.01。

2.2 各組小鼠肝臟組織中TC、TG含量測(cè)定結(jié)果

脂肪肝模型小鼠肝臟組織勻漿中TC、TG含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)；益腎健脾利濕方組和二甲雙胍組小鼠肝臟組織中TC、TG含量顯著低于脂肪肝模型組(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠肝臟組織勻漿中TC、TG含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與脂肪肝模型組比較，bP<0.01。

2.3 各組小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量測(cè)定結(jié)果

脂肪肝模型小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)；益腎健脾利濕方組和二甲雙胍組小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量顯著低于脂肪肝模型組(P<0.01)。結(jié)果見表3、表4。

表3 各組小鼠血清中TC、TG含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與脂肪肝模型組比較，bP<0.01。

表4 各組小鼠血清中ALT、AST含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與脂肪肝模型組比較，bP<0.01。

3 討論

肝臟是碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的合成與水解的主要場(chǎng)所，任何導(dǎo)致脂肪代謝紊亂的因素均可致肝臟脂肪異位沉積，形成脂肪肝，其中非酒精性脂肪肝發(fā)展迅速，易從單純性脂肪肝演變成脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌[9-11]，嚴(yán)重威脅人類健康。因此對(duì)酒精性脂肪肝的研究與治療具有重要意義。肝臟TG輸出不足可引起脂質(zhì)大量堆積導(dǎo)致脂肪肝，而乙硫氨酸與甲硫氨酸結(jié)構(gòu)相似，可與之競(jìng)爭(zhēng)取代甲基而提供乙基致使肝臟蛋白合成障礙，載脂蛋白合成減少，TG蓄積于肝臟而形成脂肪肝[12-13]。本實(shí)驗(yàn)采用乙硫氨酸誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠NAFLD模型，結(jié)果顯示脂肪肝模型組小鼠肝臟系數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，提示建模成功。

目前治療非酒精性脂肪肝的藥物主要有減肥藥、胰島素增敏劑、肝細(xì)胞保護(hù)劑、調(diào)血脂藥、抗氧化劑等[14]，這些藥物往往存在下肢輕度水腫、轉(zhuǎn)氨酶增高及肝臟毒性等不良反應(yīng)。益腎健脾利濕方由茵陳蒿湯、六味地黃丸加參苓白術(shù)散組成，其中茵陳蒿湯出自《金匱要略》，主治濕熱停聚導(dǎo)致的陽黃，原文為“谷疸之為病，寒熱不食，食即頭眩，心胸不安，久久發(fā)黃，為谷疸，茵陳蒿湯主之”，其癥“身黃如橘子色”與脂肪性肝炎具有相同的臨床表現(xiàn)，有研究表明茵陳蒿湯能夠有效改善NAFLD；六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，具有調(diào)節(jié)免疫和鈣磷代謝、降血糖、降血脂、保護(hù)肝臟等多種作用；參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，為中醫(yī)治療脾虛證的經(jīng)典方劑，具有調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、降低肝脂和減輕肝臟損傷的作用[15-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益腎健脾利濕方組小鼠肝臟系數(shù)顯著低于脂肪肝模型組，表明益腎健脾利濕方對(duì)乙硫氨酸誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝具有保護(hù)作用。

TC是所有脂蛋白所含膽固醇的總和，包括游離膽固醇和膽固醇脂，主要合成和貯存于肝臟，其含量可作為脂代謝的主要指標(biāo)；TG主要在肝臟和脂肪組織中合成，是機(jī)體儲(chǔ)存能量的重要形式。由于肝臟脂肪化，其氧化分解能力降低，脂肪合成增多，機(jī)體TC、TG水平呈現(xiàn)不同程度的升高。ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞內(nèi)，血清中較少，當(dāng)肝細(xì)胞膜通透性增加或嚴(yán)重受損時(shí)，ALT和AST被釋放入血液，血清中ALT和AST水平就會(huì)升高[19-21]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了小鼠肝臟組織中TC、TG含量和血清中TC、TG、ALT、AST含量，結(jié)果顯示脂肪肝模型小鼠肝臟組織中TC、TG含量和血清中TC、TG、ALT、AST含量顯著升高，益腎健脾利濕方可顯著降低肝臟組織中TC、TG含量和血清中TC、TG、ALT、AST含量，從而起到對(duì)NAFLD的保護(hù)作用。

綜上所述，益腎健脾利濕方對(duì)小鼠NAFLD具有保護(hù)作用，可降低肝臟系數(shù)，其保護(hù)作用可能通過降低肝臟組織中TC、TG水平和血清中TC、TG、ALT、AST水平等途徑來實(shí)現(xiàn)。益腎健脾利濕方(茵陳、大黃、梔子、柴胡、白術(shù)、丹參、山藥、茯苓、澤瀉、熟地黃、枸杞子、淫羊藿、雞血藤、甘草和大棗)由茵陳蒿湯、六味地黃丸加參苓白術(shù)散組成，具有健脾利濕、疏肝活血之功效，用于在NAFLD療效顯著，本研究為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，利于臨床推廣使用。