基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病腎病的潛在作用機(jī)制

陳璟 徐墜成 徐貝貝 許惠琴 呂志陽(yáng)

摘 要：目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，進(jìn)一步探討補(bǔ)中益氣湯防治糖尿病腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP：http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲得補(bǔ)中益氣湯的活性成分及其作用靶點(diǎn)，從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集與糖尿病腎病相關(guān)的靶標(biāo)基因，將藥物作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶標(biāo)基因取交集得到該方治療糖尿病腎病的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，使用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape軟件將結(jié)果可視化。借助DAVID和ClueGo對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和KEGG富集。結(jié)果：該方法找出了補(bǔ)中益氣湯182個(gè)活性成分和41個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)其中DPP4，MAPK14，MAPK3，MAPK8，MMP2，MMP3，MPO，MTTP，NOS3等關(guān)鍵基因主要通過(guò)調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路，Toll樣受體信號(hào)通路，cAMP信號(hào)通路，白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路，Relaxin信號(hào)通路，在細(xì)胞外泌體，細(xì)胞間隙，細(xì)胞核中發(fā)揮作用。結(jié)論：通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)補(bǔ)中益氣湯防治糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)該方劑對(duì)糖尿病腎病的潛在作用機(jī)制，可能主要參與抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝及氧化應(yīng)激等過(guò)程，為闡明補(bǔ)中益氣湯對(duì)糖尿病腎病的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)中益氣湯;糖尿病腎病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

中圖分類號(hào)：R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病較為常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要原因。中藥復(fù)方在治療糖尿病及其并發(fā)癥具有很大的潛力，并在臨床上也取得了很好的效果。補(bǔ)中益氣湯為中醫(yī)臨床常用經(jīng)典方劑之一，記載于《內(nèi)外傷辨惑論》，具有多年的臨床使用經(jīng)驗(yàn)，對(duì)防治糖尿病及其并發(fā)癥起到了很好的臨床療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是中藥藥理的研究從“單個(gè)成分-單個(gè)靶點(diǎn)-單個(gè)疾病”向“多基因-多靶點(diǎn)-復(fù)雜疾病”的模式轉(zhuǎn)變。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)補(bǔ)中益氣湯所含的活性成分進(jìn)行篩選，并與疾病基因關(guān)聯(lián)得到關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析以求更為系統(tǒng)的了解補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病腎病的機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 活性成分作用靶點(diǎn)的獲取及收集

使用TCMSP平臺(tái)篩選出口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的活性成分。通過(guò)TCMSP尋找活性成分的作用靶點(diǎn)，使用uniprot將活性成分的作用靶點(diǎn)的名稱導(dǎo)入，找出其與人類相關(guān)的基因并進(jìn)行整理，得到活性成分作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2 糖尿病腎病疾病靶點(diǎn)的獲取及收集

GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)基本覆蓋了幾大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于基因的分析數(shù)據(jù)，是人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)提供簡(jiǎn)明的基因組，蛋白質(zhì)組，轉(zhuǎn)錄，遺傳和功能上所有已知和預(yù)測(cè)的人類基因。使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取

將藥物活性成分作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)基因取交集，獲得補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/Version11.0）是用于預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，其數(shù)據(jù)來(lái)自眾多來(lái)源的信息，包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算預(yù)測(cè)方法和公共文本集，可用于檢索蛋白/基因相互作用。將補(bǔ)中益氣湯處方治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，將研究物種為選擇為人類，獲得蛋白互作關(guān)系，將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)大小與Degree值大小成正比。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)生物功能注釋及通路分析及可視化

DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）的網(wǎng)址是http：//david.abcc.ncifcrf.gov/。DAVID是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表（成百上千個(gè)基因ID或者蛋白ID列表）提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學(xué)信息（GO分析和KEGG通路分析）。筆者將關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO富集分析，選擇生物過(guò)程（biological process），分子功能（molecular function），和細(xì)胞組成（cellular component）3個(gè)模塊。然后使用Cluego對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析，選擇KEGG，設(shè)定P<0.05以確定關(guān)鍵靶點(diǎn)富集通路。Cluego利用kappa統(tǒng)計(jì)學(xué)建立的，反映了基于相關(guān)基因之間相似性的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 “活性成分——靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將182個(gè)活性成分，774個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化。其中按度值排名前20的有quercetin，PTGS2，CALM1，HSP90AB1，ESR1，NOS2，AR，PPARG，F(xiàn)10，PRSS1，PAL_GLEAN10007028，kaempferol，NCOA2，ESR2，SCN5A，GSK3B，CDK2，PTGS1，CCNA2，MAPK14。

2.2 補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)收集

通過(guò)GeneCards平臺(tái)收集糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)基因，與活性成分作用靶點(diǎn)取交集后最終獲得41個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。關(guān)鍵靶點(diǎn)具體為：ACHE、ADIPOQ、ADRB1、APOB、BCL2、CREB1、CRP、CYP19A1、DPP4、DRD1、E2F1、EGF、ESR1、GSK3B、HAS2、HIF1A、HMGCR、HSPA5、HTR2A、IGF2、IL1B、JUN、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MMP2、MMP3、MPO、MTTP、NOS3、PLAT、PLAU、PPARD、PTGS1、SELE、SIRT1、SPP1、STAT3、THBD、VCAM1。

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，將研究物種為選擇為人類，將minimum required interaction score設(shè)置為大于0.9，獲得蛋白基因互作關(guān)系。將結(jié)果TSV格式導(dǎo)出，再將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，度值排名前八的有STAT3，JUN，MAPK3，MAPK1，ESR1，CREB1，MAPK14，MAPK8，表明這些靶點(diǎn)在補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病腎病中有著重大的作用。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分析

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)FDR篩選得到22個(gè)條目（FDR<0.05），網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)激活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控葡萄糖代謝，血管生成，MAP激酶活性，脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路等路徑，在細(xì)胞外泌體，細(xì)胞間隙，細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.5 KEGG通路分析

筆者采用Cytoscape中的插件ClueGO來(lái)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中在AGE-RAGE信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路、松弛素（Relaxin）信號(hào)通路。這些途徑在氧化應(yīng)激、炎癥、腎纖維化等方面具有良好的作用。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)補(bǔ)中益氣湯防治糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)該方劑對(duì)糖尿病腎病的潛在作用機(jī)制，可能主要參與抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝及氧化應(yīng)激等過(guò)程，為闡明補(bǔ)中益氣湯對(duì)糖尿病腎病的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。但本研究還存在一些缺陷，主要是未對(duì)預(yù)測(cè)獲得的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和有關(guān)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步深入探討其復(fù)雜的過(guò)程和作用機(jī)制，本課題將會(huì)結(jié)合上述結(jié)果進(jìn)行更深一步的實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)：

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81073111，81374029，81874359）;江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161371）;江蘇省高校自然基金（18KJB36011）

作者簡(jiǎn)介：陳璟（1987-），男，漢族，在讀博士研究生，講師，研究方向：中藥藥理與中藥藥劑。

*通訊作者：呂志陽(yáng)（1983-），男，漢族，黑龍江人，博士，講師，主要從事藥物新型給藥系統(tǒng)和適應(yīng)性研究。