一例鴨病毒性肝炎與圓環(huán)病毒混合感染的實驗室診斷

中圖分類號：S858.324.4+3 ? ? 文獻標識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2020）4-0034-03

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的，以肝臟病變?yōu)橹饕卣鞯囊环N高度致死性傳染病，主要侵害1月齡以內(nèi)的雛鴨[1]。DHV主要包括鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）、鴨星狀病毒1型和2型，其中DHAV屬于小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬[2]。根據(jù)中和試驗檢測結(jié)果，DHAV可分為3個血清型：DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。目前，國內(nèi)流行的主要為DHAV-1和DHAV-3毒株，其中DHAV-1為DHAV的經(jīng)典毒株，而DHAV-3是分離的DHAV新型毒株[3]。近年來，我國DHAV-3的出現(xiàn)以及DHAV-1和DHAV-3在一些地區(qū)的共流行，已經(jīng)給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成重大損失。

鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是近些年新發(fā)現(xiàn)的禽類病毒病原。根據(jù)病毒基因組序列可以分為I型和II型，目前在我國主要養(yǎng)鴨地區(qū)流行毒株以I 型為主[4]。DuCV可以感染各日齡和品種鴨，也可以感染鵝。DuCV主要侵害免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機體免疫力降低而易于繼發(fā)其它疾病，與其它鴨病毒混合感染普遍[5]，造成生產(chǎn)上診療困難，耽誤最佳治療時期。

近期實驗室接診了某養(yǎng)殖公司送檢的疑似鴨病毒性肝炎病例，通過實驗室診斷確定為DHAV-3和DuCV-I混合感染，現(xiàn)報道如下，以期為該地區(qū)鴨病毒性肝炎和鴨圓環(huán)病毒的防控提供有效參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?病料采集與處理 ?發(fā)病鴨來自山東地區(qū)某養(yǎng)鴨場30日齡櫻桃谷鴨，表現(xiàn)精神萎靡，采食下降，死亡率0.25%左右。剖檢可見肝臟條紋狀出血，腎臟腫脹明顯，脾腫大，少量心包積液，有的胰腺點狀出血。采集病死鴨肝臟、脾臟和胰腺等作為病料，混合后以1：5比例加入滅菌生理鹽水，使用組織勻漿機將病料打碎形成混懸液，置-80℃凍融2次，4℃ 8000g離心15min，取上清進行實驗室PCR檢測。

1.2 ?PCR鑒定

1.2.1 ?組織核酸提取 ?處理好的病料上清按照試劑盒（Axyen）說明書提取病毒核酸，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?引物設(shè)計和PCR檢測 ?利用本實驗室設(shè)計的針對禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨呼腸孤病毒（DReoV）、鴨細小病毒（DPV）和鴨圓環(huán)病毒（DuCV）等常見病原的引物，通過PCR或RT-PCR方法進行病毒核酸檢測。

PCR反應(yīng)體系25μL：2×Taq PCR StarMix 12.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，DNA模板2μL，超純水9.5μL。擴增條件：94℃預(yù)變性2min;94℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 90s，35個循環(huán);72℃延伸5min。

RT-PCR反應(yīng)體系20μL：2×One Step Mix 10μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，One Step Enzyme Mix 1μL，超純水5μL，RNA模板3μL。擴增條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性2min;94℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 30s，35個循環(huán);72℃延伸5min。

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。并將PCR陽性樣品進行測序。

2 ?結(jié)果

2.1 ?病理解剖與病變觀察 ?剖檢6只病死雞，主要眼觀病理變化為肝臟條紋狀出血，見圖1;腎臟腫大呈花斑狀，見圖2。

2.2 ?實驗室PCR檢測 ?病毒核酸檢測結(jié)果顯示，DHAV-3為陽性，電泳條帶大小為240bp;DuCV-I為陽性，電泳條帶大小為460bp;其他常見病毒均為陰性。結(jié)果見圖3。

3 ?討論

近年來隨著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；芗B(yǎng)殖模式的增多，鴨疾病爆發(fā)的危害更加嚴重。由于免疫壓力等因素的影響，鴨甲型病毒性肝炎呈現(xiàn)出新的流行態(tài)勢。1963年在中國首次報道了該病[6]，隨后，國內(nèi)越來越多的鴨肝炎病毒毒株（DHAV-1）被發(fā)現(xiàn)。2002年，蘇敬良等報道了一例新型鴨肝炎病毒（DHAV-3），且DHAV-1和DHAV-3之間交叉保護力很差[7]。何冉婭等對華南地區(qū)分離的18株DHV進行病原學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)有15株為DHAV-3[8]。Fu等對28份死亡雛鴨的肝臟樣品進行核苷酸序列分析和血清型分析，分離到15株DHAV-3[9]。

目前，DHAV-3已成為引起我國鴨肝炎的主要病原之一，且流行地域分布存在不斷擴大的態(tài)勢。目前，沒有商品化的疫苗用于DHAV-3的防控，雖然DHAV-1和DHAV-3抗體可以用于鴨甲型病毒性肝炎治療，但實際生產(chǎn)中，DHAV仍時有發(fā)生，這可能與混合感染其他鴨病毒有關(guān)。

在本病例中，除DHAV-3以外還檢測到DuCV-I型病毒。DuCV最初在德國發(fā)現(xiàn)，隨后在美國、韓國、中國等國家發(fā)現(xiàn)并流行[10]。鴨圓環(huán)病毒主要引起鴨生長發(fā)育不良，生產(chǎn)性能下降，免疫器官萎縮，淋巴組織受損，引起免疫抑制，通常與其他病原體共同感染使疾病進展更加復(fù)雜[11]。

DuCV感染陽性率高低不一，近年來我國山東、福建、廣東養(yǎng)鴨大省的感染情況日趨嚴重[12]。DuCV病毒分離較困難，因此沒有商品化的疫苗產(chǎn)品可供使用。該病以預(yù)防為主，養(yǎng)殖場應(yīng)采取嚴格的生物安全手段，嚴防鴨圓環(huán)病毒病的發(fā)生和流行。

鴨病毒性肝炎和鴨圓環(huán)病毒病均是當前危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要傳染病。由于DuCV感染普遍存在，近來DHAV病例經(jīng)常能夠同時檢測到DuCV，因此推測這可能是DHAV防控失敗的原因之一。但是，由于缺乏實驗證據(jù)，DHAV和DuCV 是否能夠協(xié)同致病以及其協(xié)同致病機理仍需進一步研究。

參考文獻：

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[12] ?陶廣朋.鴨圓環(huán)病毒的流行與防控[J].中國畜禽種業(yè)，2019，15（09）：192.