套細胞淋巴瘤C-myc基因、LSD1表達及臨床意義

鄒宗楷 陳順平 林燕玲 紀(jì)思靈 黃智勇

[摘要] 目的 探究套細胞淋巴瘤C-myc基因、LSD1表達及臨床意義。 方法 回顧性分析2010年1月～2015年12月就診于我院的30例套細胞淋巴瘤（MCL）患者的臨床資料，將其納入研究組，并將同時期的30例增生性淋巴結(jié)炎患者臨床資料納入對照組。采用SP免疫組織化學(xué)方法檢測兩組病例病理組織中C-myc、LSD1蛋白表達情況，并應(yīng)用小干擾RNA（siRNA）沉默套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞的C-myc基因，Western blot檢測C-mycsiRNA作用后凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達水平。分析C-myc、LSD1蛋白表達與套細胞淋巴瘤臨床病理分期的相關(guān)性及C-mycsiRNA對套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3的影響。 結(jié)果 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，C-myc、LSD1蛋白表達與MCL臨床病理分期無相關(guān)性（P>0.05）。C-mycsiRNA處理Jeko-1細胞24 h后，Western blot 檢測顯示凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達呈濃度依賴性下降。 結(jié)論 C-myc、LSD1蛋白表達與MCL臨床病理分期無相關(guān)性，干擾Jeko-1細胞C-myc基因后可下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達水平，C-myc基因可能成為靶向治療的新靶點。

[關(guān)鍵詞] 套細胞淋巴瘤;C-myc;LSD1;相關(guān)性;siRNA;凋亡相關(guān)蛋白

[中圖分類號] R733.1? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）08-0147-04

Expression of C-myc gene and LSD1 in mantle cell lymphoma and its clinical significance

ZOU Zongkai CHEN Shunping LIN Yanling JI Siling HUANG Zhiyong

Department of Pathology， Zhangzhou Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Zhangzhou 363000， China

[Abstract] Objective To explore the expression of C-myc gene and LSD1 in mantle cell lymphoma and its clinical significance. Methods The clinical data of 30 patients with mantle cell lymphoma（MCL） who were treated in our hospital from January 2010 to December 2015 were retrospectively analyzed and included as the study group， and 30 patients with proliferative lymphadenitis in the same period were included as the control group. SP immunohistochemistry was used to detect the expression of C-myc and lysine specific demethylase 1（LSD1） proteins in the pathological tissues， and small interfering RNA（siRNA） was used to silence the C-myc gene of MCL Jeko-1 cells. Western blot was used to detect the expression of apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3 after C-myc siRNA treatment. The correlation between the expression of C-myc and LSD1 proteins and the clinicopathological stage of MCL and the effect of C-myc siRNA on the apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3 of MCL Jeko-1 cells was analyzed. Results Spearman correlation analysis showed that there was no correlation between C-myc and LSD1 protein expression and clinical pathological stage of MCL（P>0.05）. After C-myc siRNA treatment of Jeko-1 cells for 24 hours， Western blot showed that the expression of apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3 decreased in a concentration-dependent manner. Conclusion There is no correlation between the expression of C-myc and LSD1 proteins and the clinical pathological stage of MCL. Interfering with the C-myc gene in Jeko-1 cells can down-regulate the expression of apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3. The C-myc gene may become a new target for targeted therapy.

[Key words] Mantle cell lymphoma; C-myc; LSD1; Correlation; siRNA; Apoptosis-related protein

非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkins lymphoma，NHL）是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，而套細胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）占NHL的5%～6%，其會導(dǎo)致患者淋巴結(jié)腫大，并常常伴隨全身癥狀[1]。大部分MCL患者在確診時多為中晚期病變，且多已出現(xiàn)外周血或骨髓浸潤，危及患者生命，需及早診斷與治療。組蛋白去甲基化酶（Histone demethylases，HDM）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methytransferases，HMT）共同調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化狀態(tài)，進而調(diào)控染色質(zhì)的基因表達及結(jié)構(gòu)改變。C-myc基因可促進細胞增殖及分裂，與NHL的發(fā)生密切相關(guān)[2]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（Lysine specific demethylase l，LSD1）可調(diào)控基因的表達，使細胞內(nèi)一、二甲基化的組蛋白3賴氨酸4（H3K4）去甲基化[3]。但目前有關(guān)NHL中C-myc、LSD1表達的研究較少。因此，本實驗進一步探究C-myc、LSD1在套細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2010年1月～2015年12月就診于我院的30例MCL患者臨床資料，將其納入研究組，并將同時期的30例增生性淋巴結(jié)炎患者臨床資料納入對照組。MCL診斷符合《套細胞淋巴瘤診斷與治療中國專家共識（2016年版）》[4]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理組織學(xué)及免疫組織化學(xué)確診。研究組中男21例，女9例;年齡51～78歲，平均（66.20±2.50）歲;經(jīng)典型25例，多形性型1例，母細胞型4例。Costwolds臨床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。對照組中男22例，女8例;年齡52～77歲，平均（66.15±2.45）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清、PMSF以及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，型號分別為E600001-0500、A610425-0025、C503051-0500;Lipo 2000購自Invitrogen公司，型號為11668-019;psPAX2購自巴菲爾公司;兔單抗CD81（26KD）、鼠單抗CD63（26KD）均購自abcam公司，型號分別為Ab109201、Ab108950;全自動免疫組織化學(xué)染色儀為美國羅氏 BenchMark XK。

1.3 方法

（1）采用全自動免疫組化檢測套細胞淋巴瘤和增生性淋巴結(jié)炎C-myc、LSD1蛋白表達，構(gòu)建兩組患者的組織芯片，SP法免疫組織化學(xué)染色，以PBS代替一抗作為陰性對照，用購買的陽性對照片作為陽性對照。結(jié)果根據(jù)著色強度和著色細胞所占百分比的積分之和進行判斷，若兩種積分之和>2分為陽性，≤2分為陰性，計算各組的平均積分。由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法評估。（2）套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞生長于含10%胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)基，并在37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。根據(jù)C-myc基因在GenBank中的序列原則設(shè)計相對應(yīng)特異性siRNA。轉(zhuǎn)染前選擇對數(shù)生長期細胞，離心收集并接種于6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染時細胞密度達到8×105～16×105/mL。設(shè)定空白對照組、隨機陰性對照組。將稀釋后的lipofectamineTM2000室溫放置5 min后與稀釋的C-myc siRNA混合并室溫放置20 min以便形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物0.5 mL，將其加入含有細胞的無抗培養(yǎng)基中，使終體積為2 mL。在培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2飽和濕度）中培養(yǎng)24 h后，提取各組細胞總mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測各組LSD1基因表達水平。WB方法檢測C-mycsiRNA作用24 h后Jeko-1細胞凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達。（3）病理檢查：標(biāo)本10%濃度的中性福爾馬林固定后常規(guī)進行石蠟切片、HE染色和免疫組化染色，用顯微鏡觀察細胞組織形態(tài)和免疫組化染色結(jié)果，由2名資深病理醫(yī)師共同診斷。

1.4 評價指標(biāo)

（1）分析套細胞淋巴瘤病理組織中C-myc、LSD1蛋白表達與臨床病理分期相關(guān)性。①臨床病理分期：Ⅰ期：腫瘤局限于單個淋巴結(jié)或淋巴區(qū);Ⅱ期：入侵≥2個淋巴結(jié)或淋巴區(qū)，但仍在橫膈膜單側(cè);Ⅲ期：腫瘤細胞擴散于橫膈膜兩側(cè);Ⅳ期：腫瘤細胞已轉(zhuǎn)移至多個器官。②分級根據(jù)著色細胞所占比例與著色強度綜合判斷。C-myc無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)<10%為1分，10～30%為2分，>30%為3分。LSD1無陽性細胞記為0分，陽性細胞數(shù)量按<25%、25～50%、51～75%、>75%分別記為1分、2分、3分、4分。著色強度按無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分。將以上二者得分相加，0分為Ⅰ級，1～2分為Ⅱ級，3～4分為Ⅲ級，5～7分為Ⅳ級。Ⅳ級為陽性高表達。由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師根據(jù)雙盲法評估。（2）探究C-mycsiRNA對套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達水平的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C-myc蛋白表達與臨床病理分期相關(guān)性分析

C-myc與MCL臨床病理分期無相關(guān)性（r=0.000，P>0.05）。見表1。

2.2 LSD1蛋白表達與臨床病理分期相關(guān)性分析

LSD1表達與MCL臨床病理分期無相關(guān)性（r=0.000，P>0.05），見表2。LSD1的陽性產(chǎn)物主要定位在細胞核，其在MCL中的表達見封三圖12。

2.3 C-myc siRNA對套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

C-myc siRNA處理Jeko-1細胞24 h后，Western blot 檢測顯示凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達呈濃度依賴性下降，見圖1、封三圖13。

3 討論

MCL屬于惡性淋巴瘤，具有侵襲性與惰性，早期無明顯癥狀，大部分患者確診時多為Ⅲ或Ⅳ期病變，且多無法治愈，嚴(yán)重威脅患者生命安全[5-6]。目前，采用CHOP方案治療MCL患者的療效不滿意，僅有少數(shù)患者可得到完全緩解，因此，尋求更好的治療方案，尤其是探究新型治療靶點十分必要。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，MCL病理組織中C-myc、LSD1蛋白表達與臨床病理分期無相關(guān)性。分析原因在于，C-myc基因是一種轉(zhuǎn)錄因子，也是一種癌基因，可通過易位重排與基因擴增方式活化，與多種腫瘤密切相關(guān)。腫瘤的發(fā)生可能與C-myc基因、細胞周期素CyclinD1、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Procaspase3協(xié)同作用有關(guān)。C-myc基因與其產(chǎn)物C-myc蛋白可調(diào)節(jié)G1細胞周期分布、細胞增殖、分化、并可以促進DNA的復(fù)制、與某些腫瘤的發(fā)生過程密切相關(guān)[7-8]。

組蛋白共價修飾包括組蛋白甲基化、磷酸化、乙酰化等過程，是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容[9]。其中組蛋白甲基化異常會導(dǎo)致對應(yīng)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，影響下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，使其控制細胞增殖、分化、凋亡水平紊亂，進而誘發(fā)腫瘤[10-11]。LSD1是第一個組蛋白去甲基化酶，結(jié)構(gòu)由三部分組成，包括一個胺氧化酶結(jié)構(gòu)域、一個SWIRM結(jié)構(gòu)域以及中心TOWER塔形結(jié)構(gòu)域 。LSD1可促使H3K4和H3K9等單、雙甲基化的賴氨酸去甲基化[12-13]。鄒宗楷等[14]于相關(guān)研究中對LSD1、H3K4mel、H3K4me2在MCL中的高陽性表達進行比較，并分析三者間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LSD1在MCL中呈高表達，可對H3K4的甲基化水平進行調(diào)節(jié)，其與腫瘤的關(guān)系與H3K9甲基化水平上升、H3K4甲基化水平下降相關(guān)。LSD1可通過H3K4甲基化及去甲基化異常來影響MCL細胞周期及增殖、凋亡，進而促進腫瘤發(fā)展[15]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種新興基因阻斷技術(shù)。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)抑制LSD1的轉(zhuǎn)錄水平，可降低LSD1mRNA和相關(guān)蛋白的表達，進而可明顯MCL細胞株的增殖分化活性。

C-myc siRNA處理套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞24 h后，Western blot 檢測顯示凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達呈濃度依賴性下降，同時可激活凋亡效益因子Procaspase3轉(zhuǎn)化為caspase3，引發(fā)程序性細胞凋亡發(fā)生，說明干擾C-myc基因后可下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達水平。C-myc基因可能成為靶向治療的新靶點，其原因在于RNA干擾（RNAi）屬于新型基因阻斷技術(shù)，小干擾RNA（siRNA）可抑制C-myc基因的轉(zhuǎn)錄水平，降低C-mycmRNA和凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而對套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞株的增殖分化活性進行抑制。

綜上所述，套細胞淋巴瘤中C-myc、LSD1蛋白表達與Costwolds臨床病理分期無相關(guān)性，干擾套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞中C-myc基因可下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表達水平，影響細胞增殖分化活性，C-myc基因可能成為靶向治療的新靶點。

[參考文獻]

[1] 周萍，石遠凱，何小慧，等. 套細胞淋巴瘤患者的臨床特征及預(yù)后因素分析[J]. 中華腫瘤雜志，2014，36（12）：928-932.

[2] 黃文亭，郭蕾，鄭波，等. C-myc蛋白表達水平與C-myc基因易位相關(guān)性分析及其臨床應(yīng)用[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2016，32（10）：1110-1112.

[3] 劉航，丁杰，劉振華，等. 賴氨酸特異性去甲基化酶1抑制劑與腫瘤治療的研究進展[J].中華實驗外科雜志，2018，35（10）：1980-1983.

[4] 中國抗癌協(xié)會血液腫瘤專業(yè)委員會，中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會白血病淋巴瘤學(xué)組，中國抗淋巴瘤聯(lián)盟. 套細胞淋巴瘤診斷與治療中國專家共識（2016年版）[J]. 中華血液學(xué)雜志，2016，37（9）：735-741.

[5] 詹麗芬，黃軼群，陳強，等. 單胺氧化酶抑制劑苯乙肼對套細胞淋巴瘤細胞生長增殖的影響及相關(guān)機制研究[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志，2017，25（4）：1030-1035.

[6] 楊嘉駱，周從明. 非霍奇金淋巴瘤細胞株中Wnt信號通路功能檢測及siRNA敲低Wnt信號通路對細胞活力的影響[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，21（7）：871-873.

[7] 鮑麗麗. C-myc基因在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的研究進展[J]. 國際輸血及血液學(xué)雜志，2015，38（5）：436-440.

[8] 俞今晶，來純云. C-myc在腫瘤中的表達及功能[J]. 國際腫瘤學(xué)雜志，2017，44（4）：278-280.

[9] 白煜，李明杰，樊麗萍，等. 卵巢癌組織中LSD1、NDRG1基因表達量與癌細胞遷移、侵襲的相關(guān)性研究[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2018，24（4）：437-439，443.

[10] 李滸，張中國，周震，等. 組蛋白賴氨酸去甲基化酶在腫瘤中的作用[J]. 生物技術(shù)通訊，2018，29（1）：109-113， 118.

[11] 林秀梅，唐燕，王順清，等. 干擾組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1基因?qū)毙园籽L-60和SHI-1細胞增殖及凋亡的影響[J]. 白血病·淋巴瘤，2016，25（2）：94-98.

[12] 何艷新，龐志剛，申東方，等. 賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1在肝細胞型肝癌組織的表達及對細胞增殖及侵襲力的影響[J]. 中華實驗外科雜志，2019，36（3）：533-536.

[13] 陳江，李雪松，王子衛(wèi)，等. 賴氨酸特異性去甲基化酶1功能及與腫瘤關(guān)系的研究進展[J]. 貴州醫(yī)藥，2019，43（7）：1039-1043.

[14] 鄒宗楷，黃軼群，沈洪武，等. 套細胞淋巴瘤中LSD1、H3K4me1、H3K4me2蛋白表達及臨床意義[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2015，31（12）：1402-1404.

[15] 林燕玲，鄒宗楷，蘇海燕，等. miR-101和EZH2在套細胞淋巴瘤中的表達及其臨床意義[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志，2019，27（3）：820-826.

（收稿日期：2019-12-26）