三種固定劑對(duì)氯化金染色大鼠運(yùn)動(dòng)終板效果的比較

李良奎 劉茂生 習(xí)亞州 彭艷春 徐秋霞 黃鑫 顧銀中

[摘要] 目的 對(duì)比分析25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛3種固定劑對(duì)氯化金染色運(yùn)動(dòng)終板的效果。 方法 選用30只SD大鼠，體重180～220 g，雌雄不拘。進(jìn)行10次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取3只，取右側(cè)肱二頭肌，分別置于25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛溶液中固定后，行氯化金鍍金法，光學(xué)顯微鏡下觀察運(yùn)動(dòng)終板的形態(tài)結(jié)構(gòu)和背景顏色。結(jié)果 3種固定劑固定的運(yùn)動(dòng)終板邊緣整齊，中央顏色淺于周圍，部分運(yùn)動(dòng)終板中央呈空泡狀。甲酸固定的肌纖維排列有序，橫紋清晰，呈紫紅色;乙酸固定的肌纖維排列有序，無清晰的橫紋，呈紫藍(lán)色，但染色較淺，與運(yùn)動(dòng)終板形成的反差較小;甲醛固定的肌纖維排列雜亂，無橫紋，呈紫紅色、粉紅色、紫黑色和藍(lán)色等多種顏色。 結(jié)論 甲酸固定的運(yùn)動(dòng)終板氯化金染色效果優(yōu)于乙酸和甲醛，甲酸固定的肌組織需要的還原時(shí)間少于乙酸和甲醛。因此，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)終板染色選擇固定劑時(shí)，25%甲酸在3種固定試劑中可作為最佳選擇。

[關(guān)鍵詞] 固定劑;運(yùn)動(dòng)終板;肱二頭肌;鍍金法

[中圖分類號(hào)] R322? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）08-0031-03

Comparison of the effects of three fixatives on gold chloride-stained rats

LI Liangkui? ?LIU Maosheng? ?XI Yazhou? ?PENG Yanchun? ?XU Qiuxia? ?HUANG Xin? ?GU Yinzhong

Department of Human Anatomy， Zhuhai Campus， Zunyi Medical University， Zhuhai? ?519041， China

[Abstract] Objective To compare and analyze the effects of 25% formic acid， 25% acetic acid and 4% formaldehyde on gold chloride-stained sports endplates. Methods Thirty SD rats weighing 180-220 g were selected. 10 experiments were performed. 3 experiments were randomly selected for each experiment. The right biceps were taken and fixed in 25% formic acid， 25% acetic acid and 4% formaldehyde solution respectively， and then treated with gold chloride-stained method. The morphology and background color of the sports endplates were observed under an optical microscope. Results The edges of the sports endplates fixed by the three fixatives were neat and the center was lighter in color than the surroundings. Some of the sports endplates were hollow in the center. Formic acid-fixed muscle fibers were arranged in an orderly manner with clear stripes and purple-red. Acetic acid-fixed muscle fibers were arranged in an orderly manner without clear stripes and were purple-blue in color， but the staining was lighter and the contrast with the motor endplates was small. The formaldehyde-fixed muscle fibers were arranged in a disorderly manner， without stripes， and had a variety of colors such as magenta， pink， purple black， and blue. Conclusion The gold chloride staining effect of formic acid-fixed sports endplates is better than that of acetic acid and formaldehyde， and the reduction time of formic acid-fixed muscle tissue is less than that of acetic acid and formaldehyde. Therefore， 25% formic acid can be the best choice among the 3 kinds of fixatives when selecting the fixatives for sports endplate staining.

[Key words] Fixative; Motor endplates; Biceps bram; Gold plating

運(yùn)動(dòng)終板是神經(jīng)支配骨骼肌運(yùn)動(dòng)的特化結(jié)構(gòu)[1]，其功能是將神經(jīng)發(fā)出來的電信號(hào)傳遞到骨骼肌內(nèi)，支配骨骼肌的伸縮運(yùn)動(dòng)[2-3]，骨骼肌運(yùn)動(dòng)依賴于完整的運(yùn)動(dòng)終板。當(dāng)今社會(huì)，各類意外事故和地質(zhì)災(zāi)害直接或間接地導(dǎo)致受傷人員周圍神經(jīng)不同程度的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)終板的退化和肌肉的萎縮[4-7]。運(yùn)動(dòng)終板染色能顯示周圍神經(jīng)損傷和修復(fù)過程中運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)目和形態(tài)，從而判斷其退行性變的程度和再生重建的效果，而運(yùn)動(dòng)終板染色的質(zhì)量將直接影響到對(duì)周圍神經(jīng)損傷和修復(fù)程度的評(píng)估。氯化金鍍金染色是顯示運(yùn)動(dòng)終板的常用方法，其步驟分為取材、固定、染色、還原、軟化和鏡檢。在染色過程中，選擇不同固定試劑對(duì)染色效果有著顯著影響?，F(xiàn)代研究中常用的固定劑有25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛[8-10]，這3種固定試劑均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)[11-12]，且在運(yùn)動(dòng)終板染色中，由于缺乏相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行對(duì)比分析的報(bào)道，故本研究選擇這3種固定劑為研究對(duì)象，對(duì)比分析3種固定劑對(duì)氯化金染色運(yùn)動(dòng)終板的效果，從而篩選出最佳的固定劑，為進(jìn)行運(yùn)動(dòng)終板染色選擇固定劑提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純，批號(hào)：20180102）、冰乙酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)：20180103）、甲醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)：20180301）、丙三醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)：20180115）、氯化金（天津市邁斯科化工有限公司，分析純）、顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，30只，體重180～220 g，雌雄不拘，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002]提供。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制? 將氯化金溶于PBS溶液，配制成1%氯化金溶液;甲酸、乙酸和甲醛用純凈水分別配制成25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛的固定試劑。

1.3.2 取材? 進(jìn)行10次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取3只SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，將其固定于鼠手術(shù)板上，取右側(cè)肱二頭肌，剝離肱二頭肌周圍的結(jié)締組織，生理鹽水洗凈肱二頭肌。

1.3.3 固定? 將3塊肱二頭肌分別放入50 mL25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛溶液中固定35 min，待肌組織呈半透明狀態(tài)時(shí)，取出肌組織用蒸餾水洗凈固定液，濾紙吸干水分。

1.3.4 染色? 固定后的組織放入1%氯化金中染色100 min（避光），取出肌組織用蒸餾水漂洗后，再用濾紙吸干。

1.3.5 還原? 染色后的肌組織放入50 mL 25%甲酸溶液中進(jìn)行還原，甲酸、乙酸和甲醛固定的肌組織還原時(shí)間分別為24 h、32 h和69 h，還原至肌組織中央呈紫紅色、周圍呈暗褐色。取出肌組織用自來水反復(fù)清洗，然后用蒸餾水漂洗數(shù)次，以徹底洗凈還原液，再用濾紙吸干多余水分。

1.3.6 軟化? 還原后的肌組織放入丙三醇軟化6～12 h。

1.3.7 鏡檢? 從丙三醇中取出肌組織，用濾紙吸掉表面的丙三醇，順著肌纖維的方向切取大小為1 mm×1 mm×4 mm肌組織于載玻片上，滴加1滴中性樹膠，蓋上蓋玻片并輕壓蓋玻片，使肌纖維分散開，在光學(xué)顯微鏡下尋找并觀察運(yùn)動(dòng)終板。壓片時(shí)切忌用力過大，避免損壞運(yùn)動(dòng)終板。有研究報(bào)道[13]，采用雙蓋法封片，有利于標(biāo)本的保存。

2 結(jié)果

2.1 三種固定試劑固定肌組織肉眼觀及一般情況

氯化金染色實(shí)驗(yàn)的不同階段，3種固定劑固定的肌組織、肉眼觀及一般情況不盡相同。在固定、染色后，肌組織外觀相似;還原后的肌組織外觀各有其特點(diǎn)，還原時(shí)間相差較大，肌組織柔韌度和壓片情況也存在差異。見表1。

2.2 運(yùn)動(dòng)終板與肌纖維鏡下觀

神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)終板被氯化金染成黑色，神經(jīng)末梢像“爪”樣附著于肌纖維上，與肌纖維連接處膨大呈橢圓形或球形，此即運(yùn)動(dòng)終板。3種固定劑固定的運(yùn)動(dòng)終板邊緣整齊，中央顏色淺于周圍，部分運(yùn)動(dòng)終板中央呈空泡狀。甲酸固定的肌纖維排列有序，橫紋清晰，呈紫紅色（封三圖1～2）;乙酸固定的肌纖維排列有序，無清晰的橫紋，呈紫藍(lán)色，但染色較淺，與運(yùn)動(dòng)終板形成的反差較小（封三圖3～4）;甲醛固定運(yùn)動(dòng)終板較模糊，肌纖維排列雜亂，無橫紋，呈紫紅色、粉紅色、紫黑色和藍(lán)色等多種顏色（封三圖5～6）。

3 討論

在運(yùn)動(dòng)終板染色中，3種固定劑固定的肌組織所需要的還原時(shí)間相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此，為了確定它們的最佳還原時(shí)間，在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)之前，以還原時(shí)間為自變量額外增加一組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索，通過對(duì)比分析運(yùn)動(dòng)終板的清晰度和背景顏色，最終明確，經(jīng)甲酸、乙酸和甲醛固定的肌組織需要的最佳還原時(shí)間分別為24 h、32 h和69 h。本研究發(fā)現(xiàn)，乙酸還原時(shí)間不足，背景顏色太黑，顯微鏡下無法尋找和觀察運(yùn)動(dòng)終板;甲醛還原時(shí)間過長，背景顏色太紅，運(yùn)動(dòng)終板顯示不清。本研究說明，在同等條件下，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)終板染色選用甲酸固定劑能節(jié)約大量時(shí)間。

在本研究中，甲醛固定的肌組織、神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)終板較模糊，肌纖維呈現(xiàn)多種顏色，出現(xiàn)這種改變可能與甲醛的物理和化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，經(jīng)甲醛固定的肌組織會(huì)使肌組織縮小和變韌，這可能造成氯化金未能均勻、快速地浸入肌組織進(jìn)行染色。此外，甲醛水溶液的弱酸性pH值會(huì)達(dá)到某些蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)水平[14]，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性最差，易與甲醛發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)，從而改變肌組織原來的結(jié)構(gòu)，使染色性質(zhì)改變。甲醛的這些性質(zhì)，可能會(huì)影響氯化金對(duì)肌組織的染色效果，進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)終板的觀察結(jié)果。

本研究顯示，三種固定劑固定的運(yùn)動(dòng)終板均有中央淺染，甚至中央呈空泡狀的現(xiàn)象，其原因可能與固定劑溶液的酸性有關(guān)。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，酸性固定劑會(huì)使細(xì)胞內(nèi)含物溶解，這可能是甲酸、乙酸固定運(yùn)動(dòng)終板形成空泡狀的原因。而甲醛分子結(jié)構(gòu)中含有碳氧雙鍵，化學(xué)性質(zhì)活潑，在水溶液中易發(fā)生Cannizzaro反應(yīng)生成甲酸[14]，這可能是甲醛固定運(yùn)動(dòng)終板也形成空泡狀的原因。此現(xiàn)象可能會(huì)影響對(duì)運(yùn)功終板原始形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。

綜上所述，甲酸固定的運(yùn)動(dòng)終板氯化金染色效果優(yōu)于乙酸和甲醛，且在還原時(shí)間上，甲酸固定的肌組織需要的還原時(shí)間少于乙酸和甲醛。不足之處在于3種固定劑固定的運(yùn)動(dòng)終板均有中央淺染，甚至中央呈空泡狀的現(xiàn)象，這可能會(huì)影響觀察運(yùn)動(dòng)終板的原始形態(tài)結(jié)構(gòu)?？傊姿峁潭ǖ倪\(yùn)動(dòng)終板在效果和還原時(shí)間上均優(yōu)于乙酸和甲醛。因此，在觀察運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行氯化金染色時(shí)，25%甲酸在三種固定試劑中可作為最佳選擇。

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（收稿日期：2019-10-24）