響應(yīng)面優(yōu)化丑橘皮精油提取及其抑菌性

樊迎，王雪婷，郭雅嫻，劉暢，董鵬飛

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院（晉中 030800）

丑橘又名丑柑，屬于雜柑的一種，學(xué)名“不知火”，是蕓香科柑橘屬植物的一種新型品種水果。因其口感極佳，已成為近年來深受消費(fèi)者喜愛的柑橘類水果。皮作為柑橘類水果的非食用部位，占鮮果質(zhì)量的20%～40%[1]。柑橘類水果皮中含有豐富的精油、微量元素、果膠、橙色素等[2]。其中，柑橘類水果皮精油具有令人愉悅的天然柑橘香氣，不僅氣味清新怡人，而且具有抑菌[3]、護(hù)肺[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[5]、保鮮[6]等作用，被稱為“液體黃金”，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)中。

目前，從柑橘類水果的果皮中提取精油的方法主要有壓榨法[7]、溶劑浸提法[8]、水蒸氣蒸餾法[9]、超（亞）臨界流體萃取法[10-11]、超高壓法[12]等，也有不少學(xué)者會同時輔以超聲[13]、微波[14]、酶解[15]等手段，以提高精油提取的效率和品質(zhì)。研究表明，采用溶劑浸提法提取的桔皮精油，香味濃，檸檬烯含量高[16]，且此法操作簡便、成本低，有較大的推廣價值。鮮見有丑橘皮精油提取的相關(guān)報道。試驗(yàn)采用超聲波輔助溶劑萃取法提取丑橘皮精油，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到提取丑橘皮精油的最佳工藝，并對其抑菌性進(jìn)行初探，以期為丑橘資源的綜合利用、精深加工及應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮丑橘，市售。試劑：石油醚、95%乙醇、正己烷，均為AR，天津市北辰方正試劑廠；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；菌種：細(xì)菌（枯草芽孢桿菌），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏；酵母菌（安琪高活性干酵母），購于市場；霉菌（青霉），分離自發(fā)霉的橘皮表面。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

CG-8200多功能研磨機(jī)，中山市長柏電器實(shí)業(yè)有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB-3200DT超聲波儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；R206D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-2F超凈工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DH2500電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市通利信達(dá)儀器廠；等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

丑橘洗凈、去皮，將丑橘皮分批次放入烘箱中，于45 ℃烘干至恒質(zhì)量。用多功能研磨機(jī)粉碎，過40目篩，得到丑橘皮粉，置于無菌密封袋中備用。

1.3.2 丑橘皮精油提取工藝

用電子天平稱取若干份10.00 g的丑橘皮粉，按照一定的料液比加入提取溶劑，超聲功率設(shè)置為100 W[17]，在一定溫度下浸提一段時間，過濾得到丑橘皮精油提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行減壓蒸餾分離溶劑后，得到丑橘皮精油，其得率按照式（1）計算：

1.3.3 提取條件的研究

以丑橘皮精油得率為考察指標(biāo)，先研究提取溶劑（正己烷、95%乙醇、石油醚）對提取效果的影響，確定出最優(yōu)提取溶劑，后續(xù)試驗(yàn)均以此溶劑作為提取劑；然后研究超聲浸提溫度、提取時間、料液比這3個因素對丑橘皮精油提取得率的影響。固定初始條件：浸提溫度45 ℃、提取時間50 min、料液比1∶6（g·mL-1）。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行操作，取平均值進(jìn)行分析。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理，以丑橘皮精油得率為響應(yīng)值，浸提溫度（A）、提取時間（B）和料液比（C）為3個試驗(yàn)因素，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。運(yùn)用Design-Expert V 8.0.6軟件系統(tǒng)進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立回歸模型，確定丑橘皮精油的超聲輔助提取法的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)各因素水平及編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

1.3.5 丑橘皮精油抑菌性試驗(yàn)

1.3.5.1 菌懸液的制備

細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，酵母菌和霉菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。取受試菌種接種到提前制備好的液體培養(yǎng)基中活化24 h，重復(fù)2次后，取活化好的菌種，配成106～108個/mL的菌懸液，備用。

1.3.5.2 抑菌效力測定[18]

采用濾紙片擴(kuò)散法測定細(xì)菌的抑菌效力，先分別取0.1 mL枯草芽胞桿菌和酵母菌的菌懸液、青霉的孢懸液，倒入培養(yǎng)皿中涂抹均勻，直到感覺有黏稠感產(chǎn)生。取直徑大小為6 mm無菌濾紙小圓片，在丑橘皮精油中充分浸泡12 h后放置于平板中，以6 mm未浸泡過丑橘皮精油的濾紙片放入含菌培養(yǎng)皿中作為對照，所有操作均進(jìn)行3次重復(fù)。酵母菌和青霉在28 ℃下培養(yǎng)48 h，枯草芽胞桿菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，測抑菌圈直徑并取平均值。敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)[19]：抑菌圈直徑大于20 mm，極敏感；15～20 mm，高敏感；10～15 mm，中敏感；8～10 mm，低敏感；小于7 mm，不敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 丑橘皮精油提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑的確定

分別用3種有機(jī)溶劑來提取丑橘皮精油，結(jié)果見圖1。

圖1表明，用所選的3種溶劑提取丑橘皮精油，得率由高及低依次為：正己烷＞石油醚＞95%乙醇。95%乙醇的提取效果及精油品質(zhì)均不佳。石油醚和正己烷是較好的提取劑，二者的精油得率均較高，且差異不大。石油醚提取所得精油為橙黃色、澄清透明，正己烷提取得到的精油為黃色，稍顯黏稠，澄清度不及前者。加之石油醚具有價格優(yōu)勢，故選用石油醚作為后續(xù)試驗(yàn)的提取溶劑。

2.1.2 超聲浸提溫度對丑橘皮精油得率的影響

運(yùn)用上組定好的提取溶劑，在其他條件一致的情況下，改變丑橘皮粉的浸提溫度，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，隨著溫度升高，丑橘皮精油得率逐漸升高，當(dāng)浸提溫度為55 ℃時，丑橘精油得率最高，再升高溫度，得率不再呈原有的緩慢平緩升高趨勢，超過55 ℃后，反而呈現(xiàn)出微下降趨勢。因?yàn)榫鸵讚]發(fā)，提高浸提溫度并不能一直提高丑橘皮精油得率，超過一定溫度后，丑橘皮精油揮發(fā)散失量增大，得率由此而降低。圖2折線總趨勢趨于平緩，說明溫度對丑橘皮精油得率影響稍弱。最佳浸提溫度為55 ℃。

圖1 不同提取溶劑對丑橘皮精油提取效果的影響

圖2 超聲浸提溫度對丑橘皮精油得率的影響

2.1.3 超聲時間對丑橘皮精油得率的影響

在前2組確定的提取溶劑和浸提溫度條件下，只改變超聲輔助提取的時長，所得丑橘皮精油得率如圖3所示。

從圖3可知，隨著超聲輔助提取時間的延長，丑橘皮精油得率有較大幅度的升高，當(dāng)超聲波提取時間為60 min時，丑橘精油得率最高，隨后繼續(xù)增加提取時間，丑橘皮精油得率反而略有下降，這可能是因?yàn)槌曁幚頃r間過短，丑橘皮細(xì)胞壁破裂及胞內(nèi)熱效應(yīng)程度低，精油無法完全溶出，隨著超聲處理時間的延長，丑橘皮細(xì)胞壁破裂程度提高，精油充分溶出，但如果超聲處理時間過長，則其升溫效應(yīng)會導(dǎo)致部分丑橘皮精油揮發(fā)，導(dǎo)致得率下降[20]。因此超聲最佳處理時間為60 min。

2.1.4 料液比對丑橘皮精油得率的影響

在前3組確定的溶劑、浸提溫度和超聲時間條件下，研究不同料液比對丑橘皮精油提取得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4顯示，丑橘皮粉與石油醚的比例在1∶2～1∶6（g·mL-1）的范圍內(nèi)，丑橘皮精油得率隨著料液比的增加而升高，這主要是因?yàn)閷τ谝欢康某箝倨し郏黾恿弦罕?，丑橘皮粉與石油醚接觸面的濃度差就越大，越有利于丑橘精油從細(xì)胞組織中脫離出來；當(dāng)料液比大于1∶6（g·mL-1）時，精油得率并沒持續(xù)上升，反而出現(xiàn)下降的情形，這是由于繼續(xù)增加溶劑用量，部分超聲波輻射能會被溶劑吸收[21]，同時，其他脂溶性成分競爭溶解量增加，導(dǎo)致丑橘皮精油的得率降低。綜上所述，料液比取1∶6（g·mL-1）最合適。

圖3 超聲時間對丑橘皮精油得率的影響

圖4 料液比對丑橘皮精油得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在Box-Behnken試驗(yàn)原理的基礎(chǔ)上，以超聲輔助丑橘皮精油提取的浸提溫度（A）、提取時間（B）和料液比（C）為自變量，丑橘皮精油得率（Y）為響應(yīng)值，用Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平的二次多項(xiàng)式回歸擬合分析。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析

應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6軟件對表2中的丑橘皮精油得率結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，所建立的二次回歸模型為：Y=2.548+0.118 75A+0.255B+0.226 25C-0.027 5AB+0.015AC+0.062 5BC-0.164A2-0.381 5B2-0.204C2。對此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型的F值為87.84、p值＜0.01，表明模型顯著，失擬項(xiàng)p值=0.095 6＞0.05，說明失擬項(xiàng)差異不顯著，可知此模型可很好地描述丑橘皮精油得率和各提取因素之間的關(guān)系；同時，此模型的決定系數(shù)R2=0.991 2，調(diào)整系數(shù)AdjR2=0.979 9，表明此模型擬合程度好，可以解釋響應(yīng)面中99.12%的可變性，總變異中只有2.01%不能用此模型解釋。故可認(rèn)為所選用的二次回歸模型是合適的，未知因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響很小，可以較準(zhǔn)確地預(yù)測丑橘皮精油的提取得率。F值越大，說明此因素對丑橘皮精油提取得率的影響越大，故可判斷出所考察的這3種因素影響大小順序?yàn)椋禾崛r間（B）＞料液比（C）＞浸提溫度（A）。模型中一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2均對丑橘皮精油提取得率的影響達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)BC對其影響達(dá)到顯著水平，說明超聲輔助提取時間和料液比2個因素對丑橘皮精油提取得率的影響并非簡單的線性關(guān)系，有必要做交互作用分析。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表3 丑橘皮精油得率的方差分析表

通過對模型方程求導(dǎo)，得到方程的最優(yōu)解即丑橘皮精油的預(yù)測得率的最大值（2.685%），此值對應(yīng)的各因素最佳條件分別為：浸提溫度（A）56.3 ℃、提取時間（B）61.3 min、料液比（C）1∶6.13（g·mL-1）。

2.2.2 最佳提取工藝驗(yàn)證

為了驗(yàn)證丑橘皮精油提取的最佳工藝條件，同時考慮實(shí)際操作的可行性，將最佳提取條件設(shè)置為提取溫度56 ℃、超聲輔助提取時間61 min、固液比1∶6.1（g·mL-1），在此條件下重復(fù)驗(yàn)證3次所得到的丑橘皮精油的得率為2.68%±0.09%，與預(yù)測值十分接近，說明此二次多項(xiàng)式回歸方程對丑橘皮精油得率的預(yù)測是可靠的，此試驗(yàn)條件可用于超聲輔助丑橘皮精油的提取優(yōu)化。

2.2.3 響應(yīng)面及交互作用分析

響應(yīng)曲面圖和等高線圖是經(jīng)過軟件繪制的，分別為三維立體曲面圖和二維平面生成的等高線圖，可直觀反映出各個因素的單獨(dú)作用效果和因素交互作用結(jié)果，如圖5～圖7所示。

圖5 浸提溫度和提取時間對丑橘精皮油得率的交互作用

圖6 浸提溫度和料液比對丑橘精皮油得率的交互作用

圖7 浸提時間和料液比對丑橘精皮油得率的交互作用

觀察圖5～圖7的響應(yīng)面圖，發(fā)現(xiàn)均為開口向下的曲面圖，顯示為負(fù)值，形如山丘一樣中間拱起，而四周相對較低的曲面，代表著存在有極大值[19]。比較3個曲面圖，可以看出提取時間的曲線最陡峭，表明其對丑橘皮精油提取得率的影響最大，這與2.2.1中方差分析結(jié)果相一致；通過比較3個等高線圖，發(fā)現(xiàn)提取時間和料液比的交互作用最顯著，表現(xiàn)為等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形且最密集。而其他2個等高線圖則更接近于圓形，且排列不太密集，對應(yīng)的響應(yīng)面圖線也較為平緩，說明浸提溫度和料液比、浸提溫度和提取時間之間的交互作用對丑橘皮精油得率的影響不顯著。

2.3 丑橘皮精油的抑菌性能

試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌、酵母菌和青霉3種供試菌種作為研究丑橘皮精油抑菌性的對象，考察丑橘精油的抑菌能力。由表4可知，丑橘皮精油對于各類微生物均有著抑制作用，并產(chǎn)生明顯的抑菌圈，而在對照試驗(yàn)中，沒有出現(xiàn)明顯的抑菌圈，說明試驗(yàn)結(jié)果可以作為丑橘皮精油抑菌性能試驗(yàn)的理論依據(jù)。其中：霉菌的抑菌圈最小，說明丑橘皮精油對于霉菌的抑菌效果最弱；枯草芽胞桿菌的抑菌圈最大，說明抑制枯草芽胞桿菌對丑橘皮精油高度敏感，而對酵母菌抑制能力一般。

表4 丑橘精油抑菌性測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)首先通過3種提取劑對比，確定石油醚為丑橘皮精油的最佳提取溶劑；根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用相響應(yīng)曲面法優(yōu)化分析，并結(jié)合實(shí)際操作得到丑橘皮精油提取的最優(yōu)工藝：浸提溫度56 ℃、超聲輔助提取時間61 min、料液比1∶6.1（g·mL-1）。此最優(yōu)條件下丑橘皮精油得率最高可達(dá)到2.68%±0.09%。該方法成本低廉、操作簡便、提取時間短，可為丑橘資源的綜合開發(fā)利用提供理論參考。

提取所得丑橘皮精油對各類微生物均有不同程度的抑菌能力，其對枯草芽胞桿菌抑制能力最強(qiáng)，其次為酵母菌，而對霉菌的抑菌性一般。今后，可對丑橘皮精油進(jìn)行純化后進(jìn)一步分析其抑菌成分，探究其抑菌機(jī)理。這不僅可以提高丑橘的利用價值，還將為食品貯藏保鮮、化妝品開發(fā)、天然清新劑研制等領(lǐng)域提供新的應(yīng)用思路，發(fā)展前景廣闊。