一測(cè)多評(píng)方法應(yīng)用于高效液相色譜法測(cè)定防曬產(chǎn)品中15種防曬劑的含量

郭 潔,劉 齊,劉成浩,韓蕭茜,楊 玲,杜 勇

(北京市藥品檢驗(yàn)所,北京102206)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步,人們對(duì)健康和美麗的追求愈加強(qiáng)烈。為了避免紫外線輻射對(duì)皮膚造成的各種損傷以及追求白皙膚色的審美要求,采取積極有效的防曬措施已經(jīng)成為大眾的共識(shí)。為滿足人民群眾日益增長(zhǎng)的需要,研究人員不斷研發(fā)多種配方多種劑型的防曬產(chǎn)品,使用頻率呈現(xiàn)明顯的增大趨勢(shì)。但防曬劑的過(guò)多使用,會(huì)使人體產(chǎn)生諸如過(guò)敏、接觸性皮炎等不良反應(yīng)[1-7]。因此,國(guó)家對(duì)防曬產(chǎn)品的監(jiān)管和要求日趨嚴(yán)格,如防曬劑應(yīng)與批準(zhǔn)配方一致,且應(yīng)在產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)明,其含量應(yīng)符合相產(chǎn)規(guī)定。2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[8]中,規(guī)定了苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的高效液相色譜方法,所測(cè)定項(xiàng)目涵蓋了目前市售防曬產(chǎn)品中使用的絕大多數(shù)化學(xué)類防曬劑,可準(zhǔn)確測(cè)定其含量。但是該方法需要同時(shí)使用15種標(biāo)準(zhǔn)品,提高了檢測(cè)成本,分別配制對(duì)照品溶液也增加了操作時(shí)間,不利于檢驗(yàn)工作的高效完成。

一測(cè)多評(píng)法整合了內(nèi)標(biāo)、校正因子、紫外百分吸收系數(shù)等方法的優(yōu)勢(shì),借助待測(cè)物中有效成分的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系,以一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品為參照物,建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子,并通過(guò)其計(jì)算含量,實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)測(cè)定。該方法可以減少標(biāo)準(zhǔn)品使用數(shù)量,降低檢測(cè)成本,節(jié)約檢測(cè)時(shí)間,已經(jīng)在中藥材、中成藥及食品的質(zhì)量評(píng)價(jià)中得到了較為廣泛的應(yīng)用[9-21]。

本工作依據(jù)文獻(xiàn)[22-24]的技術(shù)要求,建立一種簡(jiǎn)便高效的測(cè)定防曬產(chǎn)品中多種防曬劑含量的分析方法,確定以二苯酮-3為參照物,采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮-4、對(duì)氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二甲基PABA乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲?；淄?、奧克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水楊酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪等15種防曬劑的含量,并采用回歸方程法同步測(cè)定并加以驗(yàn)證。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Aglient-1100型高效液相色譜儀;島津LC-20AD高效液相色譜儀;Waters e2695型高效液相色譜儀(方法學(xué)考察所用);Mettler Toledo XS-205型電子分析天平;SB-25-12D型超聲波清洗器;Mili-Q Advantage型純水機(jī)。

苯基苯并咪唑磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:4.950 g·L－1,稱取適量苯基苯并咪唑磺酸標(biāo)準(zhǔn)品,用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中,用體積比為250∶450∶300∶0.2的甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合溶液(以下簡(jiǎn)稱為混合溶劑)稀釋至刻度,混合均勻。

二苯酮-4、對(duì)氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二甲基PABA乙基己酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量,用稀釋溶劑溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中,用混合溶劑稀釋至刻度,混合均勻,配制5.073,5.060,5.041,5.226,5.048,5.123 g·L－1的二苯酮-4、對(duì)氨基苯甲酸、二苯酮-3、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二甲基PABA乙基己酯的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

丁基甲氧基二苯甲?；淄?、奧克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水楊酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量,用四氫呋喃溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中,用四氫呋喃稀釋至刻度,混合均 勻,配制 5.018,5.393,5.208,5.089,5.323,1.088,1.036,1.007 g·L－1的丁基甲氧基二苯甲?；淄?、奧克立林、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水楊酸乙基己酯、胡莫柳酯、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

苯基苯并咪唑磺酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為155797,純度為93.6%)、二苯酮-4標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為20102,純度為99.0%)、對(duì)氨基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為112395,純度為99.9%)、二苯酮-3標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為14971-01,純度為100%)、P-甲氧基肉桂酸異戊酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為G0L414,純度為98.9%)、4-甲基芐亞基樟腦標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為 G161980,純度為99.0%)、4-甲基芐亞基樟腦標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為102303,純度為99.0%)、二甲基PABA乙基己酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為102303,純度為99.2%)、丁基甲氧基二苯甲?；淄闃?biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為40814,純度為98.9%)、奧克立林標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為752831,純度為98.7%)、甲氧基肉桂酸乙基己酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為B0002222,純度為99.8%)、水楊酸乙基己酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為G131868,純度為99.4%)、胡莫柳酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為40429,純度為99.6%)、乙基己基三嗪酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為F0 H178,純度為99.5%)、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為G155801,純度為99.9%)和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為F0G275,純度為98.7%)等15種防曬劑標(biāo)準(zhǔn)品。

四氫呋喃和甲醇均為色譜純;高氯酸為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

CAPCELL PAK C18色 譜 柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流量為1.0 mL·min－1;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為311 nm;進(jìn)樣體積為10.0μL。流動(dòng)相:A為甲醇,B為四氫呋喃,C為0.008 2 mol·L－1高氯酸溶液,梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.3 試驗(yàn)方法

取本品棄去部分(細(xì)頸容器內(nèi)樣品棄去最初擠出的1 cm樣品,廣口容器內(nèi)樣品刮棄表面層),稱取0.25 g樣品于25 mL具塞試管中,加15 mL混合溶劑溶解,渦旋混勻,超聲提取30 min,用稀釋溶劑稀釋至刻度,在8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心10 min,移取上清液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用稀釋溶劑定容,混合搖勻后經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾,得到待測(cè)溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對(duì)15種防曬劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和編號(hào)為291的實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 15種防曬劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 15 sunscreen agents mixed standard solution and the substantial sample

由圖1可知:15種防曬劑的分離效果良好,且該方法對(duì)于實(shí)際樣品中防曬劑的測(cè)定無(wú)干擾,說(shuō)明該方法對(duì)于測(cè)定防曬產(chǎn)品中的防曬劑是可行的。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照儀器工作條件對(duì)15種防曬劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以各防曬劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:15種防曬劑在一定范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系,線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear range,linear regression equation and correlation coefficient

表2 (續(xù))

2.3 精密度試驗(yàn)

對(duì)15種防曬劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次,記錄各防曬劑的峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn):苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分 別 為 0.30%,0.20%,0.30%,0.20%,0.20%,0.20%,0.20%,0.30%,0.20%,0.20%,0.30%,0.60%,0.20%,0.50%,0.30%,說(shuō) 明 該 方 法的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將15種防曬劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放置0,4,8,12,24 h后進(jìn)行測(cè)定,記錄各防曬劑的峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn):苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的色譜峰面積的 RSD 分別為 0.90%,0.80%,0.80%,1.1%,0.60%,0.90%,1.2%,0.70%,0.60%,1.1%,1.4%,1.0%,0.80%,0.80%,0.70%,表 明15 種 防 曬劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。

2.5 相對(duì)校正因子的計(jì)算

試驗(yàn)采用多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算相對(duì)校正因子,計(jì)算方法見(jiàn)公式(1):

式中:fsi為相對(duì)校正因子;As為參照物標(biāo)準(zhǔn)品s的峰面積,μV·s－1;ρs為參照物標(biāo)準(zhǔn)品s的質(zhì)量濃度,mg·L－1;Ai為待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品i的峰面積,μV·s;ρi為待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品i的質(zhì)量濃度,mg·L－1。

以二苯酮-3為參照物,根據(jù)進(jìn)樣量不同,分別計(jì)算其余14種防曬劑的相對(duì)校正因子,以其平均值作為最終結(jié)果,并計(jì)算相對(duì)校正因子的RSD,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 14種防曬劑的相對(duì)校正因子Tab.3 Relative correcting factors of the 14 sunscreen agents

結(jié)果表明:不同進(jìn)樣體積所求得的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性較好,RSD為0.20%～2.0%。

2.6 相對(duì)保留時(shí)間的確定

試驗(yàn)以二苯酮-3為參照物,分別計(jì)算其余14種防曬劑的相對(duì)保留時(shí)間,計(jì)算方法見(jiàn)公式(2):

式中:tRa為待測(cè)組分的保留時(shí)間,min;tRs為參照物的保留時(shí)間,min;ras為相對(duì)保留時(shí)間。

苯基苯并咪唑磺酸等14種防曬劑的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表4。

2.7 系統(tǒng)耐用性考察

試驗(yàn)通過(guò)將本方法中所選用的CAPCELL PAK C18色譜柱更換為不同品牌型號(hào)的色譜柱(ZORBAX SB-C18色譜柱、inertsilODS-3色譜柱、Kromasil 100-5-C18(Kromasil)色譜柱和UG-120色譜柱)來(lái)考察相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):ZORBAX SB-C18色譜柱對(duì)15種防曬劑的分離效果良好,相對(duì)校正因子變化幅度較小,相對(duì)平均偏差(RAD)為0.10%～2.8%,具體見(jiàn)表5;其他型號(hào)的色譜柱對(duì)的15種防曬劑的分離效果均不理想,部分防曬劑無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離,這是由于2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[8]中15種防曬劑的測(cè)定方法對(duì)于色譜柱具有一定的選擇性。因此,在所選的色譜柱可完全分離15種防曬劑的情況下,本方法具有適用性。

表4 14種防曬劑的相對(duì)保留時(shí)間Tab.4 Relative retention time of the 14 sunscreen agents

試驗(yàn)進(jìn)一步比較了CAPCELL PAK C18色譜柱和ZORBAX SB-C18色譜柱這兩種類型的色譜柱對(duì)15種防曬劑的相對(duì)保留時(shí)間,計(jì)算RAD,結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 不同色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子Tab.5 Relative correction factors determined with different chromatographic columns

表6 不同色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention times determined with different chromatographic columns

15種防曬劑在22 min內(nèi)出峰完畢,某些防曬劑間距較近(例如峰5和峰6的出峰間隔為0.31 min,峰8和峰9的出峰間隔為0.33 min,峰11和峰12的出峰間隔為0.21 min),僅以相對(duì)保留時(shí)間定位可能造成混淆,因此在今后的試驗(yàn)中可采用適當(dāng)增加對(duì)照品定位的方式(除參照物二苯酮-3以外,還可增加對(duì)氨基苯甲酸、P-甲氧基肉桂酸異戊酯、奧克立林、水楊酸乙基己酯和乙基己基三嗪酮)輔助確定各個(gè)防曬劑的準(zhǔn)確位置,在使用少量對(duì)照品的情況下,即可準(zhǔn)確進(jìn)行多種防曬劑含量的測(cè)定。

同一液相系統(tǒng)調(diào)整柱溫后,相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好,RSD為0.10%～1.6%,具體見(jiàn)表7,表明該方法可適用于不同的試驗(yàn)環(huán)境。

表7 不同柱溫測(cè)得相對(duì)校正因子Tab.7 Relative correction factors determined at different column temperatures

分別更換不同品牌型號(hào)的液相色譜儀后,相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好,RSD為0.60%～1.7%,具體見(jiàn)表8。

試驗(yàn)表明,該方法可適用于不同的色譜系統(tǒng)。

表8 不同儀器測(cè)得相對(duì)校正因子Tab.8 Relative correcting factors determined with different instruments

2.8 樣品分析

分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法(SCM)和一測(cè)多評(píng)法(QAMS)計(jì)算24批樣品中防曬劑的含量,并計(jì)算測(cè)量值的RAD,其中批號(hào)為291、294和298的測(cè)定值和RAD見(jiàn)表9。批號(hào)為140、400和78的測(cè)定值和RAD見(jiàn)表10。

表9 批號(hào)為291、294和298的樣品分析結(jié)果Tab.9 Analytical results of samples with lot numbers 291,294 and 298 %

結(jié)果表明:兩種方法對(duì)于多個(gè)組分測(cè)定值的RAD為0.10%～2.5%,且SCM 和 QAMS的測(cè)定結(jié)果基本一致。

本工作建立了市售防曬產(chǎn)品中苯基苯并咪唑磺酸等15種防曬劑的一測(cè)多評(píng)測(cè)定方法,在改變柱溫及更換儀器的條件下,相對(duì)校正因子重現(xiàn)性較好。測(cè)定了24批市售防曬產(chǎn)品,對(duì)比了一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測(cè)定結(jié)果,證明兩種方法得到的測(cè)定結(jié)果基本一致,可以在確定色譜柱型號(hào)的前提下,實(shí)現(xiàn)以二苯酮-3為參照物,對(duì)防曬產(chǎn)品中15種防曬劑的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。原方法需稱量15種防曬劑標(biāo)準(zhǔn)品,分別制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液后,再配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定。采用一測(cè)多評(píng)方法僅需稱量二苯酮-3標(biāo)準(zhǔn)品適量,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,另取其他5種標(biāo)準(zhǔn)品配制成定位溶液,即可判斷15種防曬劑的位置,并測(cè)定其含量,大大減少了標(biāo)準(zhǔn)品的使用量,節(jié)約了操作時(shí)間、降低了分析成本且提高了工作效率,同時(shí)保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表10 批號(hào)為140、400和78的樣品分析結(jié)果Tab.10 Analytical results of samples with lot numbers 140,400 and 78 %