茉莉酸介導叢枝菌根真菌誘導番茄抗早疫病的機制

林熠斌, 楊玉瑞, 黃榮雪, 趙玉瑩, 何陳鈴, 魏曉辰, 曾任森, 宋圓圓,*

1 福建農林大學農學院作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室, 福州 350002 2 福建農林大學生命科學學院, 福州 350002 3 福建農林大學作物抗性與化學生態(tài)學研究所, 福州 350002

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是土壤微生物群落的重要組成分,能與維管束植物共生形成菌根[1]。菌根不僅能夠提高植物對P、N、Zn、Fe、Cu、Mn和Ca等礦質營養(yǎng)的吸收[2- 4],還能夠增強植物對干旱、鹽漬、重金屬、冷、熱和水淹等各種逆境脅迫的耐受能力[5- 8]。

隨著對菌根功能研究的深入,越來越多的研究表明菌根共生可以增強寄主植物對病原物的抗性,且以拮抗病原真菌的研究居多。周寶利等[9]研究發(fā)現(xiàn)AMF能夠通過提高茄子根系活力,過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性來降低茄子黃萎病(Verticilliumdahlia, Kleb)的危害。Mustafa等[10-11]報道了接種摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)的小麥通過抑制分生孢子的數(shù)量極大地增強了對小麥白粉病(Blumeriagraminisf. sp.tritici)的抗性。此外,還有少量關于AMF與植物病毒病和細菌病互作的研究。例如,Maffei等[12]研究報道接種摩西斗管囊霉能夠減輕番茄對黃葉卷曲撒丁島病毒(yellow leaf curl Sardinia virus)的感染,菌根番茄植株表現(xiàn)出輕微的癥狀和較低濃度的病毒DNA；Mora-Romero等[13]將核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和野菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.)接種到大豆和番茄葉片上,發(fā)現(xiàn)預先接種AMF的植株表現(xiàn)出更強的抗病性,同時還通過嫁接實驗表明砧木菌根誘導的抗性信號也能夠誘導非菌根接穗的抗性反應。顯然,與菌根真菌共生能夠誘導植物對病原菌的抗性非常普遍。這種抗性可能是由一種或幾種機制共同調節(jié)來起作用[14],包括改善寄主營養(yǎng)狀況[10-11, 15-16]、調節(jié)寄主次生代謝抗菌物質的合成[17- 19]、誘導寄主產(chǎn)生防御反應[20- 22]等。但目前對調控菌根誘導寄主抗病的信號轉導途徑研究比較少。

茉莉酸(Jasmonic acid, JA)及其衍生物是一類重要的植物激素,廣泛參與調控植物的生長發(fā)育、抵御逆境脅迫的系統(tǒng)響應過程[23]。許多研究表明,JA參與植物對一些病原菌的抗性反應[24-25]。Vijayan等[26]通過對擬南芥JA合成缺失三突變體fad3fad7fad8的研究發(fā)現(xiàn),JA是植物抵抗根腐生病菌(Pythiummastophorum. Drechs)所必須的,而外源施加MeJA可以恢復三突擬南芥fad3fad7fad8對P.mastophorum的抗性；Koo等[27]和Browse等[28]報道了JA缺失突變體和JA受體突變體對腐生型病原菌如畸雌腐霉菌(Pythiumirregulare)、鏈格孢菌輪斑病菌(Alternariabrassicisola)、灰霉菌(Botrytiscinerea)等侵染失去抗性。為了應對和適應各種逆境脅迫,植物通過信號轉導途徑精細協(xié)調生長和防御之間的平衡,而且這種調節(jié)也存在于菌根共生過程中[22]。越來越多的研究證明JA信號在菌根形成和菌根誘導的植物抗病性中起到積極的作用[29-30]。Cervantes-Gámez等[16]通過全基因組分析檢測菌根番茄植物葉片中基因表達的變化,并在菌根植株葉片中鑒定到742個系統(tǒng)防御誘導相關基因的表達上調,隨后對其中激素相關基因的分析發(fā)現(xiàn),AMF的定殖可能誘導植物JA的積累；Li等[15]研究也證明菌根真菌侵染后的大豆植株JA含量更高；Pozo等[22]發(fā)現(xiàn)菌根真菌侵染后番茄葉片對灰霉菌(Botrytiscinerea)感染率顯著低于對照植株,熒光定量PCR結果顯示,菌根番茄葉片受JA調節(jié)的防御基因的相對表達量顯著高于對照?？梢?菌根共生能夠誘導植物內源激素穩(wěn)態(tài)的變化,進而增強植株對逆境脅迫的耐受能力[31-32]。以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)JA信號可能參與菌根真菌對寄主植物抗病性的誘導,本研究利用番茄JA信號途徑過表達及突變體材料來進一步證明JA信號在菌根真菌誘導植物的抗病性中的重要作用,是對前人研究的補充。

番茄早疫病(tomato early blight)又稱為“輪紋病”,是由半知菌亞門鏈格孢屬茄鏈格孢菌[Alternariasolani(Ellis et G. Martin) Sorauer] 引起的一種死體營養(yǎng)型真菌病害,在我國是危害番茄的主要病害之一。主要在番茄葉、莖和果實上發(fā)病。葉片受茄鏈格孢菌侵染后,開始時出現(xiàn)暗褐色小斑點,漸漸擴大成圓形至橢圓形病斑,并有明顯的同心輪紋,邊緣具黃色或黃綠色暈圈,潮濕時產(chǎn)生黑色霉層狀態(tài)的病斑。番茄早疫病病原菌危害范圍廣泛,主要危害番茄,還會危害茄子、辣椒和馬鈴薯等多種茄科蔬菜作物。過去研究表明,植物對死體營養(yǎng)型真菌病害的抗性與JA信號途徑有關。本論文用摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)接種番茄茉莉酸信號途徑四個不同基因型材料,待菌根真菌在根系定殖后,進行早疫病菌接種和茉莉酸甲酯處理,研究JA在菌根真菌誘導的植物抗病中的作用,揭示菌根影響植物抗病的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

番茄茉莉酸信號轉導途徑前系統(tǒng)素過表達材料35S::PS(35S::prosystemin)、茉莉酸合成突變體spr2、茉莉酸信號識別突變體jai1及其對應的野生型番茄CM(SolanumlycopersicumMill.cv Castlemart)由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所李傳友研究員提供。摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae, Fm)由山東省青島農業(yè)大學菌根生物技術研究所提供,經(jīng)本實驗室用廣東省農科院提供的丹652玉米擴繁后,以含土壤、孢子、菌絲和根段的混合物作為接種物。病原菌茄鏈格孢菌[Alternariasolani(Ellis et G. Martin) Sorauer, As]由華南農業(yè)大學真菌研究室周而勛教授提供。培養(yǎng)基質土壤取自校內農場, 過10 mm篩,高壓蒸汽濕熱滅菌2次(30 min/次,103 kPa,121℃),以消除土壤中真菌孢子等其他類群微生物。

1.2 實驗設計

盆栽實驗在玻璃溫室中進行,實驗共設5個處理。對照組CK：正常健康生長的番茄植株,不進行任何處理；Fm處理：番茄幼苗根系只接種Fm 100 g (約350個孢子/100 g),番茄葉片未接種As也未噴施MeJA處理的健康番茄植株；As處理：番茄幼苗根系未接種Fm,番茄葉片未噴施MeJA處理,僅在第45天時接種As的番茄植株；Fm+As 處理：番茄幼苗根系預先接種Fm 100 g,第45天時對番茄葉片進行As接種處理,但未噴施MeJA處理的番茄植株；Fm+MeJA+As處理：番茄幼苗根系預先接種Fm 100 g,在第30天時對番茄葉片噴施MeJA,第45天時接種As。

圖1 實驗裝置示意圖 Fig.1 Sketch of experiment setup番茄幼苗移栽時接種叢枝菌根真菌摩西斗管囊霉(Fm),30 d時對葉片噴施茉莉酸甲酯(MeJA)處理,45 d時對葉片進行茄鏈格孢菌(As)處理

1.3 實驗方法

番茄種子用8% H2O2消毒10 min,滅菌水沖洗5次后催芽生長至兩葉期,隨后挑選生長一致的幼苗移栽到經(jīng)0.1% KMnO4溶液消毒的直徑為16 cm塑料花盆中。塑料盆內裝有滅菌的砂壤土2.5 kg,Fm菌劑100 g(對照未接種Fm菌劑),最后覆蓋0.5 kg滅菌的土壤。每個實驗處理設置6個重復,隨機擺放在玻璃溫室中,光周期14 h/10 h (L/D),維持相對濕度在75%,溫度22—25℃,每7 d澆一次Hoagland完全營養(yǎng)液。番茄幼苗剛移栽時接種Fm,在番茄生長30 d時每株番茄噴施10 mL MeJA (0.5 μmol/L),以等量加入Triton-X- 100的蒸餾水作為對照(圖1), 在番茄生長45 d時用噴霧法接種As分生孢子懸浮液20 mL(4×107cfu/mL),對照以等量的無菌水代替孢子懸浮液(圖1)。番茄植株生長45 d后經(jīng)乳酸酚臺盼藍染色液染色檢測根系菌根真菌侵染率。其中,MeJA配制方法：MeJA溶于等量Triton-X- 100溶液中后用蒸餾水配置成0.5 μmol/L MeJA溶液,對照則直接用等量Triton-X- 100加入等量蒸餾水。

1.4 測定指標與方法

1.4.1菌根侵染率的測定

番茄苗生長30 d和45 d 后分別用打孔器(直徑1 cm)取5個處理番茄根系各100段,放于盛有存貯液(按體積比配置是99%乙醇：60%乙酸：ddH2O=600∶120∶80)的2.5 mL塑料EP管內,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。菌根侵染率的測定參考Koske等[33]的方法稍加修改：待測根系首先用ddH2O清洗3次,去除殘留存貯液,隨后加2 mL 2% KOH,并于96℃加熱5 min；其次,用ddH2O清洗3次,去除殘留的KOH,再加2 mL 2% HCl,并于96℃加熱5 min；最后去除殘留的HCl,加入2 mL 0.05% 乳酸酚臺盼藍染色液,96℃加熱20 min染色,隨后倒掉染色液,加2 mL脫色液,脫色24 h后于Olympus BX51顯微鏡下觀察Fm侵染情況。菌根侵染率的測定采用根段侵染率加權法進行計算[34]。另采用WGA- 488(攜帶Alexa 488熒光標記的麥胚凝集素)染色液對根系進行染色,具體方法和步驟參照Jiang等[35]的方法,隨后用激光共聚焦顯微鏡LSM 510(ZEISS)觀察Fm侵染情況。

1.4.2發(fā)病率和病情指數(shù)的測定

在確定叢枝菌根真菌Fm侵染番茄植株根系后,在番茄移栽45 d時,對As、Fm+As和Fm+MeJA+As處理的番茄葉片接種茄鏈格孢菌。接種病原菌10 d后記錄發(fā)病率和發(fā)病程度。根據(jù)植株發(fā)病的程度計算病情指數(shù)[36]。發(fā)病程度分為5級,0級：葉片上無病斑；1級：病斑面積占羽狀葉的1/4以下；2級：病斑面積占羽狀葉的1/4 — 1/2；3級：病斑面積占羽狀葉的1/2 — 3/4,近一半小葉枯死；4級：病斑面積占羽狀葉的3/4以上,一半以上或全部小葉枯死。

發(fā)病率(DP)和病情指數(shù)(DI)計算公式為：

DP =(發(fā)病葉數(shù)/葉片總數(shù))×100%

DI =∑(病級葉數(shù)×發(fā)病等級)/(發(fā)病最重級數(shù)×葉片總數(shù))×100%

1.4.3抗氧化物酶活性測定

稱取1.2處理的番茄葉片0.2 g,加入2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8,內含5%聚乙烯吡咯烷酮PVPP),置冰浴上研磨勻漿,隨后轉入離心管,4℃ 12000×g離心15 min,取上清液,放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定參照袁慶華等[37]的方法；多酚氧化酶(PPO)活性測定參照朱廣廉和 鐘海文[38]的方法；脂氧合酶(LOX)活性測定參照姚鋒先等[39]的方法。

1.4.4總RNA提取和cDNA合成

對以上5種處理的番茄植株分別在接種病原菌0、5、10 d后進行葉片取樣,液氮研磨,用TrizolTMReagent試劑盒(Invitrogen,USA)提供的方法提取番茄葉片總RNA,經(jīng)DNaseI處理后,吸取2g RNA用于cDNA合成。cDNA合成體系為20L,所用試劑盒為Goscript系列Promega逆轉錄試劑盒,逆轉錄得到的cDNA放于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5熒光定量PCR分析

依據(jù)已報道參與抗蟲的相關防御基因：AOC(丙二烯氧化物環(huán)化酶基因)、COI1(茉莉酸信號受體基因)；Ubi3(番茄組成型表達基因,內參基因)的序列設計特異引物進行熒光定量PCR,擴增引物見表1。按照康為世紀的Ultra SYBR熒光定量PCR試劑盒的程序進行熒光定量PCR反應。反應條件為：95℃預變性3 min,40個循環(huán)包括95℃變性15 s,退火溫度(AOC：56.5℃；COI1：51.5℃；UBI3：51.5℃)30 s,72℃延伸15 s。引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

表1 熒光定量PCR所用的特異性引物

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013軟件錄入數(shù)據(jù)和SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,用Origin 2018軟件錄入數(shù)據(jù)和作圖,同一時間點不同處理之間的差異顯著性用Tukey′s多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 摩西斗管囊霉侵染番茄根系情況

乳酸酚臺盼藍染色結果表明,接種Fm的番茄根系(CM、35S::PS、spr2和jai1)在第30天和45天時均被侵染,且CM、35S::PS和jai1的菌根侵染率較高,而spr2的菌根侵染率最低(表2)。其中第45天時,外源施加MeJA處理的CM植株比正常生長的CM植株的菌根侵染率高出36%；外源施加MeJA處理的spr2植株比正常生長的spr2植株的菌根侵染率高出146%；而外源施加MeJA與否對35S::PS和jai1的菌根侵染率無顯著影響(表2)。從圖2可以看出,乳酸酚臺盼藍染色和WGA- 488熒光染色Fm侵染的番茄根系后,顯微鏡下能看到明顯的叢枝結構,說明Fm和寄主番茄植株形成了良好的共生關系。

表2 接種摩西斗管囊霉(Fm)30 d和45 d后番茄根系菌根侵染情況

不同小寫字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著性 (P<0.05)

圖2 臺盼藍和WGA染色下的叢枝結構 Fig.2 Arbuscular structure under trypan blue and WGA staining

2.2 不同處理對葉片防御酶活性的影響

由圖3可知,未接種As時(0 d),POD、PPO和LOX活性在不同基因型番茄植株的5個處理中均無顯著差異。其中,接種As 5 d和10 d后,同CK相比,Fm+As和Fm+MeJA+As處理的CM及35S::PS葉片中的POD酶活性被誘導升高。其中接種As 5 d后,spr2和jai1材料在各處理間的POD酶活性均無顯著差異；接種As 10 d 后,35S::PS番茄材料中POD酶活性被誘導升高(圖3)。同理,在第10天時,spr2植株的Fm+MeJA+As處理的POD酶活性高于其他4個處理,說明外源施加MeJA可增強spr2材料的抗病性,但其酶活性低于CM和35S::PS材料中相對應的處理(圖3)。而jai1材料的5個處理間的POD酶活性并無顯著差異(圖3)。在接種As 5 d、10 d后Fm+As和Fm+MeJA+As處理的CM及35S::PS葉片中的PPO酶活性被誘導升高,分別比CK高出68%,75%和67%,75%,比Fm處理高出55%,61%和55%,62%,比As處理高出52%,59%和52%,59%,而spr2和jai1材料的不同處理間PPO酶活性在接種As 5 d后無顯著差異,接種As 10 d后僅spr2植株的Fm+MeJA+As處理下PPO酶活性高于其他4個處理(圖3)。接種As 5 d后,Fm+MeJA+As處理的35S::PS番茄葉片中LOX活性明顯高于其他處理,而CM、spr2和jai1材料的不同處理間LOX酶活性無顯著差異；接種As 10 d后,CM和35S::PS番茄植株的As、Fm+As和Fm+MeJA+As處理的LOX酶活性都開始顯著上升,分別比CK高出105%,303%,335%和103%,240%,266%；且35S::PS番茄植株的Fm+As和Fm+MeJA+As處理的LOX酶活性分別比AS處理高66%和79%,差異顯著(圖3)。spr2植株的Fm+MeJA+As處理中的LOX酶活性高于其他4個處理,而jai1材料無論是否預先接種Fm、施加MeJA以及接種As,其LOX酶活性在5個處理間并無顯著差異(圖3)?？梢?CM和35S::PS植株的As、Fm+As和Fm+MeJA+As處理都可誘導POD和LOX酶活性升高；而PPO酶活性僅在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下有所升高(圖3)。spr2植株僅在Fm+MeJA+As處理的第10 d有所升高,但其酶活性低于CM和35S::PS材料中相對應的處理(圖3),說明Fm誘導番茄提高抗病性與JA是密切相關的。

圖3 接種摩西斗管囊霉和茄鏈格孢菌及茉莉酸甲酯處理對不同基因型番茄葉片過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和脂氧合酶(LOX)活性影響Fig.3 Effects of inoculation of Funneliformis mosseae and Alternaria solani, and treatment with methyl jasmonate (MeJA) on enzymes activities of peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), and lipoxygenase (LOX) in the leaves of four tomato genotypesCK：對照；Fm：番茄幼苗根系僅接種摩西斗管囊霉；As：番茄葉片僅接種茄鏈格孢菌；Fm+As：番茄幼苗根系預先接種摩西斗管囊霉后在對葉片接種茄鏈格孢菌；Fm+MeJA+As：番茄幼苗根系預先接種摩西斗管囊霉后,對葉片外源噴施茉莉酸甲酯,最后接種茄鏈格孢菌;不同小寫字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著性 (P<0.05)

2.3 不同處理對番茄茉莉酸合成途徑基因及茉莉酸受體防御啟動基因表達的影響

由圖4可以看出,第0天時,CM、35S::PS、spr2和jai1材料的不同處理的番茄葉片中AOC 和COI1基因表達量無顯著差異；第5天時,預先接種Fm并且施加MeJA處理的CM、35S::PS及spr2番茄植株在受到As侵染時,AOC基因表達量迅速升高,分別比CK高出12.2、13.1、7.4倍,比Fm處理高出11.1、12.3、7倍,比As處理高出5.7、5.1、6.2倍；接種As 10 d后,CM及35S::PS番茄植株在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下,其AOC基因被誘導表達,說明預先接種Fm番茄的AOC基因對于As侵染有更強的響應,且外源噴施MeJA會使這種響應更為迅速。隨著As侵染時間的延長,CM及35S::PS番茄葉片中AOC基因也被誘導表達。同理,接種As 5 d后,35S::PS葉片中Fm+As和Fm+MeJA+As處理下COI1基因被誘導表達,分別比CK高出2.6倍和6.1倍,CM和spr2葉片中的Fm+MeJA+As處理下COI1基因表達量分別比CK高出3.1倍和1.9倍(圖4)。接種As 10 d后,CM及35S::PS番茄葉片在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下,其COI1基因的誘導表達量分別比CK高9.5、10.3倍和9.9、6.7倍。外源噴施MeJA處理的spr2葉片中AOC和 COI1基因可被誘導表達,而jai1材料5個處理中的AOC和 COI1基因均無顯著變化(圖4)。

圖4 接種摩西斗管囊霉和茄鏈格孢菌及茉莉酸甲酯處理對不同基因型番茄葉片丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(AOC)和茉莉酸信號受體基因(COI1)的影響Fig.4 Effects of inoculation of Funneliformis mosseae and Alternaria solani, and treatment with methyl jasmonate (MeJA) on transcript levels of genes encoding allene oxide cyclase (AOC) and CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1) in the leaves of four tomato genotypesCK：對照；Fm：番茄幼苗根系僅接種摩西斗管囊霉；As：番茄葉片僅接種茄鏈格孢菌；Fm+As：番茄幼苗根系預先接種摩西斗管囊霉后在對葉片接種茄鏈格孢菌；Fm+MeJA+As：番茄幼苗根系預先接種摩西斗管囊霉后,對葉片外源噴施茉莉酸甲酯,最后接種茄鏈格孢菌。不同小寫字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著性 (P<0.05)

2.4 不同處理的番茄植株在接種早疫病菌10 d后的發(fā)病率和病情指數(shù)

由表3數(shù)據(jù)得出,由于CK及Fm處理的各基因型番茄并未接種早疫病病原菌茄鏈格孢菌(As),故發(fā)病率和病情指數(shù)均為0。而As、Fm+As以及Fm+MeJA+As處理下的4個基因型番茄均有發(fā)病,其中與單獨接種As相比,預先接種Fm可減緩CM和35S::PS番茄植株的發(fā)病率和病情指數(shù),且繼續(xù)在外源噴施MeJA后,發(fā)現(xiàn)可顯著降低番茄的發(fā)病情況(表3)。此外,35S::PS的抗病能力最強,在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下其發(fā)病率最低。預先接種Fm的spr2植株中,雖然發(fā)病趨勢有所減緩,但與僅被As侵染的spr2相比,發(fā)病率差異不顯著；而預先接種Fm在進行回補MeJA的spr2植株中,發(fā)病率和病情指數(shù)均有顯著下降(表3)。而在jai1植株中,是否預先接種Fm,以及是否進行MeJA回補,對其發(fā)病率和病情指數(shù)均無影響,早疫病發(fā)病率均達到50%以上。同理,在接種As 10 d后,CM和35S::PS植株中As、Fm+As以及Fm+MeJA+As處理間的發(fā)病率和病情指數(shù)依次降低且處理間差異均顯著(表3)。

表3 接種摩西斗管囊霉和外源添加茉莉酸甲酯對4種基因型番茄早疫病發(fā)病的影響

Table 3 Effect of mycorrhizal inoculation byFunneliformismosseaeand exogenous application of methyl jasmonate (MeJA) on early blight disease infected byAlternariasolaniain four tomato genotypes

處理Treatment病情指數(shù) Disease index發(fā)病率 Disease incidence/%CM35S::PSspr2jai1CM35S::PSspr2jai1CK0d0d0c0b0c0d0c0bFm0d0d0c0b0c0d0c0bAs34.6±3.7a28.3±2.5a48.0±3.1a56.0±9.4a42.3±3.4a31.4±2.5a52.0±3.1a54.0±9.4aFm+As22.0±5.4b17.0±5.5b43.3±3.8a58.3±4.2a33.3±5.4b14.5±5.5b48.1±3.8ab53.2±4.2aFm+MeJA+As12.3±3.8c11.3±4.3c31.6±2.7b49.6±10.9a31.0±3.8b15.8±4.3c35.6±2.7b50.1±10.9a

同列不同小寫字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著(P<0.05)

3 結論和討論

叢枝菌根真菌侵染寄主植物后會促進植物根系生長、引起植物分子和生化反應[40-42]。AMF侵染植物根系形成菌根過程中,可通過水楊酸(salicylate acid, SA)與茉莉酸信號通路來調節(jié)植物防御系統(tǒng),進而提高植物應對生物脅迫和非生物脅迫的能力[20, 31]。尤其茉莉酸信號轉導途徑在叢枝菌根真菌侵染寄主、形成菌根過程中起到非常重要的作用。Hause等[29]和Miriam等[43]的研究表明,茉莉酸一系列前體合成基因的表達,特別是AOC及Fad2在菌根結構的形成中必不可少。此外,茉莉酸在真菌性病原菌、蟲害誘導以及機械損傷的直接和間接防御反應中也起重要作用[44-45]。基于此,本實驗通過使用過表達前系統(tǒng)素轉基因番茄(35S::Prosystemin)、JA合成突變體番茄(spr2)、茉莉酸識別突變體(jai1)及其對應的野生型番茄(CM)研究了茉莉酸信號轉導途徑在菌根誘導番茄的抗病過程中的作用機制。

眾所周知,不同的信號轉導途徑由不同類型的病原菌誘發(fā),即不同的病原體侵染植物,植物啟動的信號轉導途徑就可能不同,活體營養(yǎng)型的病原微生物誘發(fā)SA依賴的信號途徑,壞死營養(yǎng)型的病原微生物或機械傷害卻觸發(fā)JA-ET(ethylene, ET)依賴的信號轉導途徑。在菌根誘導的番茄抗病防御反應中,來源于類十八烷的信號轉導途徑,即茉莉酸的信號轉導途徑,被認為在植物的防御機制中起核心作用[46-47]。該信號轉導途徑是亞麻酸通過脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)、丙二烯氧化物合酶(allele oxide sysnthase, AOS)等一系列酶促反應,最終生成植物體內重要的信號轉導物質茉莉酸及其衍生物MeJA的生物合成途徑。同樣,與植物代謝有密切關系的LOX、防御酶PPO以及作為植物體內主要抗氧化酶和活性氧清除劑的POD也參與植物的防御反應,酶活性的提高是誘導防御物質產(chǎn)生和增加防御能力的前提[48-49]。

本研究中,不同基因型番茄所表現(xiàn)出的抗病性差異,更加清晰的證明AMF與JA信號途徑之間的關系。研究結果表明,預先接種Fm的CM和35S::PS番茄,在葉片接種As(處理Fm+As)的5和10 d后,其葉片中POD、PPO和LOX活性以及AOC和COI1的轉錄水平顯著高于As、Fm和CK處理組,且發(fā)病率和病情指數(shù)也顯著降低。同時,外源噴施MeJA可增強預先接種Fm的CM和35S::PS番茄植抵抗早疫病的能力。而jai1番茄對As和MeJA處理并無防御響應,可見Fm侵染誘導提高番茄抗早疫病是與JA途徑密切相關的。此外,spr2突變體番茄植株中的Fm侵染率、酶活性和基因表達降低,可能的原因是AM孢子在侵染的過程中依賴于茉莉酸途徑來促進地上部代謝物偏向地下部運轉,菌根從中吸取營養(yǎng)進行生長代謝；也可能由于茉莉酸合成途徑的一些中間產(chǎn)物,如亞麻酸,為菌根結構建立重要的碳源,缺乏時則會造成AMF在寄主根內發(fā)育不良。在jai1突變體中,植株失去了調節(jié)外源真菌侵染的能力,使得AMF的侵染率及早疫病菌的侵染上升。對于以JA作為內源激素進行生理及抗性調節(jié)的植株來說,JA途徑的激活調節(jié)了其與周邊環(huán)境中微生物之間的關系?？梢?JA途徑的激活是AMF與番茄植株建立共生關系的必要過程,但是JA途徑主要調控的是寄主植物與AMF的共生關系,還是作為長距離運輸?shù)男盘柗肿釉诩闹髦参锸艿讲『r快速誘導系統(tǒng)防御的增強,抑或兼而有之,需要進一步研究。總之,良好共生關系的構建是AMF誘導植物提高抗病性的基礎和前提。