鐘潔,陶寧,趙利,何誠,胡建平
過敏性哮喘是一種慢性炎性氣道疾病,由多種炎性細胞介導發(fā)生,全世界大約有3.5億過敏性哮喘患者,每年增加速率大約為3%,發(fā)病率逐年上升[1]。過敏性哮喘發(fā)病機制尚不明確,近年研究發(fā)現(xiàn)[2],輔助性Th17細胞及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在哮喘發(fā)病中占有重要地位。細胞因子信號傳導抑制蛋白(SOCS)家族是一類反饋性阻斷細胞因子信號轉(zhuǎn)導過程的調(diào)節(jié)因子,由細胞因子誘導產(chǎn)生,SOCS-1、SOCS-3是SOCS家族中重要的2種分子[3-4]。T細胞亞群在免疫應答和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[5-6],SOCS-1、SOCS-3可通過調(diào)節(jié)T細胞亞群分化影響不同類型的免疫應答。研究表明[7],SOCS-1、SOCS-3可被多種炎性因子和抗炎因子誘導表達,在免疫應答和免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用。研究顯示,Th17參與多種炎性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性關節(jié)炎等[8]。體內(nèi)炎性因子的異常波動可能會引起Th17/Treg比例失衡,臨床上對于Th17/Treg失衡在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展中的意義鮮有研究報道?,F(xiàn)檢測過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平,并分析其與Th17/Treg失衡的關系及意義,報道如下。
1.1 臨床資料 選取2018年4月—2019年9月四川省遂寧市中心醫(yī)院急診科診治過敏性哮喘患者60例為哮喘組,男 31例,女29例,年齡22~54(38.15±8.23)歲;病程1~10(2.05±1.02)年;哮喘程度,輕度32例,中重度28例;患者無家族遺傳史,無其他慢性病史。選取同期醫(yī)院進行體檢的健康體檢者60例作為健康對照組,男30例,女30例,年齡24~56(39.01±8.57)歲,均經(jīng)皮膚過敏原點刺試驗為陰性,且無過敏性疾病及其他慢性疾病史,無長期用藥史,近1周內(nèi)無急性感染情況。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過,所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字,符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。
1.2 選擇標準 (1)納入標準:①符合過敏性哮喘診斷標準者,哮喘診斷標準參照全球哮喘防治創(chuàng)議(global initiative for asthma,GINA)和中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組制定的“支氣管哮喘防治指南(2016年版)”[9];②皮膚點刺試驗結(jié)果粉塵螨、戶塵螨陽性者,血清特異性IgE檢測結(jié)果為陽性(血清總IgE>200 U/ml);③無其他心血管系統(tǒng)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病等基礎疾??;④取血4周內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素、肝素、免疫抑制劑或其他影響試驗結(jié)果的藥物;⑤1周內(nèi)無急性感染,無過敏性疾病、其他慢性病史。(2)排除標準:①非過敏性哮喘患者;②皮膚過敏原點刺試驗或血清過敏原特異性抗體均為陰性者;③患有免疫系統(tǒng)疾病者。
1.3 觀測指標與方法
1.3.1 樣品制備:無菌條件下抽取2組受試者空腹狀態(tài)下外周靜脈血5 ml, 其中3 ml加入無菌肝素(20 IU/ml)抗凝管,使用密度梯度離心法對外周血單個核細胞進行分離;2 ml直接離心取血清,用于 ELISA檢測。
1.3.2 Th17細胞、Treg細胞百分率檢測:在測試管、對照管中加入外周血單個核細胞,RPMI-1640稀釋后,加入PMA和BFA二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育,使用抗人CD4-FITC、IL-17A PE孵育檢測Th17細胞百分率的樣品, CD25-PE孵育檢測Treg細胞百分率的樣品;對照管使用MouseIgG1-PE孵育進行對照。使用PBS緩沖液反復洗滌后放入流式細胞儀進行檢測[Attune NxT款流式細胞儀,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司],CD4+T細胞設門,分析門中CD4+IL-17+T細胞(Th17細胞)百分率、CD4+CD25+陽性T細胞百分率。
1.3.3 SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平檢測: 采用RNA提取試劑盒(購自北京天根生化有限公司)提取血清總RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀(CFX96型qRT-PCR儀,購自美國Bio-Rad公司)對SOCS-1、SOCS-3 mRNA進行擴增。qRT-PCR反應體系共10 μl,miScript SYBR?Green Mix 5 μl,cDNA(50 ng/μl)1 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ddH2O 3.0 μl。反應條件:95℃ 90 s,95℃ 30 s,63℃ 30 s,72℃ 15 s,45個循環(huán),AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒購自南京vazyme生物公司。SOCS-1、SOCS-3 mRNA及內(nèi)參GAPDH的引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。采用2-△△CT法對血清SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平進行定量分析。
表1 qRT-PCR引物序列
1.3.4 血清炎性因子水平檢測: 采用酶聯(lián)免疫法測定(ELX800型全自動酶標儀,購自美國Bio-Tek公司)血清白介素-6(IL-6)、IL-17、IL-23、人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、干擾素(IFN-γ)水平,檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行。IL-6 ELISA試劑盒購自Sinobiological公司;IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司;IFN-γ試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;為控制檢測質(zhì)量,本次研究所有樣品的檢測均由檢驗科同一批人員在同臺儀器上操作,每個樣本均設3次重復。
1.3.5 肺功能檢測: 選擇肺功能檢測儀對所有受試者進行肺功能檢測,檢測指標包括最大呼吸第1 s呼出氣量(FEV1)、用力肺活量(FVC)、第1 s用力呼吸容積比值(FEV1%)FEV1/FVC。
2.1 2組外周血Th17細胞、Treg細胞百分率及Th17/Treg比值比較 哮喘組外周血Th17細胞百分率、Th17/Treg比值顯著高于健康對照組(P<0.01),Treg細胞百分率顯著低于健康對照組(P<0.01),見表2。
表2 2組外周血Th17細胞、Treg細胞百分率及Th17/Treg比較
2.2 2組外周血單個核細胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平比較 哮喘組外周血單個核細胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平高于健康對照組 (P<0.01),見表3。
表3 2組外周血單個核細胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平比較
2.3 2組血清炎性因子水平比較 與健康對照組比較,哮喘組血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表達水平顯著升高(P<0.01),IFN-γ表達水平顯著降低(P<0.01),見表4。
表4 2組炎性因子水平比較
2.4 2組肺功能比較 哮喘組患者FEV1、FVC、FEV1%均顯著低于健康對照組(P<0.01),見表5。
表5 2組肺功能比較
2.5 SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg、炎性因子水平相關性分析 過敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值呈正相關(r=0.488、0.606,P<0.05),見圖1、圖2; SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平均與IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1水平呈正相關(P<0.01),與IFN-γ水平呈負相關(P<0.01);SOCS-3 mRNA水平與SOCS-1 mRNA水平呈正相關(r=0.471,P<0.01),見表6。
圖1 SOCS-1 mRNA與Th17/Treg比值相關性分析
圖2 SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值相關性分析
表6 SOCS-1、SOCS-3 mRNA與炎性細胞因子水平相關性分析
本研究發(fā)現(xiàn),過敏性哮喘患者外周血單個核細胞中SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平相對于健康對照組顯著上調(diào),提示SOCS-1、SOCS-3可能與過敏性哮喘發(fā)病有關,其中SOCS蛋白是天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中關鍵的生理性調(diào)節(jié)因子,參與調(diào)節(jié)T細胞的發(fā)育和分化、抑制細胞因子信號通路等,在免疫性疾病、感染性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[10-13]。有學者研究認為[14],SOCS-1通過SH2結(jié)構域與細胞因子受體胞內(nèi)段Janus激酶(JAK)結(jié)合,使之泛素化后降解,從而阻滯INF-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12等多種細胞因子的信號經(jīng)STAT途徑傳導。SOCS-1缺陷小鼠表現(xiàn)出T細胞大量激活的劇烈炎性反應[15]。因此,SOCS-1被認為是防止自身免疫的重要調(diào)節(jié)分子。夏家露等[16]研究發(fā)現(xiàn),SOCS-3 mRNA表達水平下調(diào)的小鼠體內(nèi)IL-4水平減少,提示IL-4水平受SOCS-3 mRNA表達水平調(diào)節(jié),二者與過敏性哮喘發(fā)生有關。說明SOCS-1、SOCS-3可能與過敏性哮喘的發(fā)病有關,推測其主要是通過調(diào)節(jié)T細胞的分化及抑制細胞因子信號通路而發(fā)揮作用。
長期以來的觀點認為,Th1/Th2失衡在過敏性哮喘中有重要作用,近年來發(fā)現(xiàn)Th17/Treg失衡在過敏性哮喘中作用同樣突出[17]。Treg不同于Th1/Th2,它可以表現(xiàn)出免疫抑制功能。初始CD4+T細胞在IL-12和IFN-γ誘導下分化為Th1細胞,參與細胞介導免疫應答;在TGF-β單獨誘導下分化為Treg細胞,分泌TGF-β,參與免疫調(diào)節(jié);在TGF-β和IL-6的共同誘導下分化為Th17,分泌IL-6和IL-17,參與炎性反應和自身免疫性疾病[18],IL-6可促進活化的CD4+細胞向Th17分化,形成正反饋。本研究發(fā)現(xiàn),哮喘組血清中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表達水平顯著升高,IFN-γ表達水平顯著降低,哮喘組Th17細胞百分率、Th17/Treg比值顯著高于健康對照組,Treg細胞百分率顯著低于健康對照組,提示Th17、Treg細胞百分率的變化和比例與過敏性哮喘有關。而有關研究發(fā)現(xiàn)[19-20],IL-6能促進急性期蛋白合成,介導前列腺素合成,從而參與哮喘的炎性反應。IL-17是一種促炎性細胞因子,可作用于氣道上皮細胞等炎性細胞,通過刺激趨化因子、細胞炎性因子等促進嗜中性粒細胞、巨噬細胞募集引發(fā)炎性反應[21]。李小明[22]研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者支氣管活檢標本IL-17水平較健康者高,且與疾病嚴重程度有關,提示IL-17參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。洪菲萍等[23]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過治療后支氣管哮喘急性發(fā)作患兒病情顯著好轉(zhuǎn),血清中IFN-γ水平顯著升高,IFN-γ有助于支氣管哮喘的診斷及病情變化的判斷。Yan等[24]研究發(fā)現(xiàn),過敏性哮喘患者外周血IL-17水平較健康對照組表達增加,說明IL-17可能在哮喘初期或疾病進展期間發(fā)揮作用,但其作用尚未確定。Guerra等[25]研究發(fā)現(xiàn),IL-23在過敏性哮喘等免疫類疾病中發(fā)揮重要作用。Chu等[26]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1在哮喘組血清中水平高于健康對照組,可能與難治性哮喘發(fā)生有關。本研究與以往研究結(jié)果相似,提示過敏性哮喘患者存在不同程度炎性反應,可能與Th17/Treg失衡有關。
進一步研究發(fā)現(xiàn),過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平與IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1呈正相關,與IFN-γ水平呈負相關;SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值呈正相關,提示SOCS-1、SOCS-3 mRNA可能通過對細胞因子的調(diào)控影響Th17、Treg的細胞數(shù)量從而影響Th17/Treg比值。
綜上所述,過敏性哮喘患者外周血中存在SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表達,以Th17細胞比率上升為主的Th17/Treg失衡,且過敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表達與Th17/Treg失衡有關。但本研究樣本量不充分,需要擴大樣本量對SOCS-1、 SOCS-3 mRNA在過敏性哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用機制進行深入研究。
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻聲明
鐘潔:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;陶寧:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;趙利:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;何誠:進行統(tǒng)計學分析;胡建平:課題設計,論文撰寫