揮發(fā)性有機(jī)物檢測在結(jié)直腸癌篩查中的研究進(jìn)展

郭穎韻綜述 田山，董衛(wèi)國審校

結(jié)直腸癌(CRC)是消化道最常見的惡性腫瘤，據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)制定的GLOBOACAN 2018統(tǒng)計(jì)數(shù)值顯示，CRC為全球第三大常見癌癥，病死率僅次于肺癌，居癌癥相關(guān)死亡原因第二位[1-2]。近年來，CRC在年輕人中的發(fā)病率逐漸攀升[3]，給社會帶來了極大的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。研究表明，早期診斷CRC及其癌前病變在提高5年生存率中起著重要作用[DukesA(T12N0M0)5年生存率93.2%,DukesC (T34N12M0)5年生存率47.7%][4]。因此，面向全民的CRC早期篩查，對CRC的防治至關(guān)重要。

根據(jù)美國癌癥協(xié)會2018年新版指南，目前CRC的篩查主要包括以下6類項(xiàng)目：糞便免疫化學(xué)檢測(FIT)、高敏感性隱血試驗(yàn)(HSgFOBT)、糞便DNA多靶點(diǎn)篩查、結(jié)腸鏡檢查、CT結(jié)腸成像、乙狀結(jié)腸鏡檢查[5]。其中結(jié)腸鏡檢查是診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于操作時患者難以耐受及檢查費(fèi)用高，限制了該項(xiàng)檢查的廣泛應(yīng)用[6]。FIT是目前應(yīng)用最廣泛的無創(chuàng)篩查方法，具有較好的特異度，但敏感度差異較大(61%～91%)，且堅(jiān)持篩查的人數(shù)很少達(dá)到目標(biāo)人群的70%[7]。近年來，檢測揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOC) 相關(guān)技術(shù)允許研究人員將揮發(fā)物與特定的病理生理變化聯(lián)系起來[8-9],VOC檢測作為一種新型腫瘤篩查方法受到關(guān)注，這為非侵入性早期CRC篩查提供了新思路，現(xiàn)就VOC檢測技術(shù)與CRC中的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 VOC產(chǎn)生及檢測方法概述

1.1 VOC的產(chǎn)生 按照世界衛(wèi)生組織的定義，VOC是指沸點(diǎn)在50～260℃之間，室溫下飽和蒸氣壓超過133.32 Pa的易揮發(fā)性有機(jī)化合物。人體散發(fā)出的VOC成分復(fù)雜，主要包括烷烴類、烯醇類、醛酮類、醇類、芳香族類等[10]。人體多種排泄物(呼出氣體、尿液、糞便、汗水等)中均可檢測到由感染、炎性反應(yīng)、腫瘤疾病和外部因素(如藥物、飲食或微生物組成的變化)引起的VOC改變[9]。 1971年，萊納斯·鮑林(Linus Pauling)在人呼出氣體中發(fā)現(xiàn)了上百種VOC，從而開啟了研究人體VOC的大門。VOC可分為外源性和內(nèi)源性兩大類。其中外源性VOC占絕大多數(shù)，它們來源于外界環(huán)境，通過肺排泄至體外，不參與機(jī)體的代謝過程；而內(nèi)源性VOC所占比例較少，為人體細(xì)胞代謝產(chǎn)物，經(jīng)由血液到達(dá)腎小管上皮細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞從而排出體外，其可直接反映體內(nèi)組織細(xì)胞的代謝情況。

VOC產(chǎn)生和改變的機(jī)制主要包括3種。第一種是微生物的代謝改變，晚期腺瘤和CRC中常伴隨腸道菌群紊亂，從而導(dǎo)致VOC成分的改變[11]。糞便中的VOC變化可反映腸道菌群的組成變化，Drees等[12]運(yùn)用VOC分析技術(shù)可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌感染早期快速診斷及感染細(xì)菌種類的識別，這為與微生物菌群失調(diào)有關(guān)的疾病中觀察糞便VOC譜的差異提供了理論依據(jù)。Baxter等[13]在研究中觀察到CRC患者中黏蛋白降解細(xì)菌——擬桿菌和阿克爾克氏菌有所增加，黏蛋白降解菌株的富集可導(dǎo)致游離氨基酸的積累。第二種是腫瘤細(xì)胞的異常代謝，腫瘤細(xì)胞的典型特征是單克隆失控性增殖及代謝異常，在惡性生長過程中發(fā)生基因突變和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)導(dǎo)致細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸被過度氧化，脂肪酸發(fā)生過氧化可生成乙烷和戊烷。此外，體內(nèi)亦存在腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死，這些過程都可能產(chǎn)生特異性的代謝產(chǎn)物從而導(dǎo)致VOC的改變[14]。Batty等[15]對比健康人與高級別腸道上皮內(nèi)瘤變患者的VOC后發(fā)現(xiàn)，由于腸道上皮內(nèi)瘤變后細(xì)胞代謝的改變，VOC中硫化氫、二甲基硫和二甲基二硫化物比例明顯增高。Sato等[16]研究表明，CRC導(dǎo)致的結(jié)腸炎性反應(yīng)同時會在CRC細(xì)胞中激活自噬，導(dǎo)致游離氨基酸的釋放。第三種是正常細(xì)胞的代謝改變，如氧化應(yīng)激增加、分解代謝增加和免疫激活。在癌癥危險因素的刺激下，氧化應(yīng)激壓力增加和細(xì)胞色素P450酶被誘導(dǎo)激活，正常細(xì)胞內(nèi)ROS和氧自由基生成和失活平衡失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，細(xì)胞中多不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，與此同時DNA、蛋白質(zhì)都會發(fā)生過氧化，產(chǎn)生可被檢測到的VOC差異[17]。

1.2 VOC檢測方法 目前VOC檢測主要有3種技術(shù)，3種檢測技術(shù)的原理及特點(diǎn)對比說明，見表1。

1.2.1 氣相色譜—質(zhì)譜法(GC-MS)： GC-MS是成功用于綜合分析VOC生物標(biāo)志物化學(xué)表征的金標(biāo)準(zhǔn)平臺[18]。該技術(shù)包括樣品收集、樣品預(yù)濃縮和樣品分析3個操作步驟。不同的樣品有不同的收集方法，若采集對象為呼出氣體，則主要運(yùn)用在線實(shí)時采樣分析、氣袋采樣、CO2濃度監(jiān)測采樣方法；尿液、血液、糞便等樣本的采樣技術(shù)在相關(guān)文獻(xiàn)均有報道；樣品的預(yù)濃縮也是VOC檢測中的一個重要環(huán)節(jié)，預(yù)濃縮利用多孔型材料的物理吸附能力，在樣品流過富集材料時，通過提升溫度使吸附樣品迅速脫附并進(jìn)入分析系統(tǒng)[19]，以達(dá)到富集樣品中痕量VOC的目的。樣品進(jìn)入分析系統(tǒng)后，GC-MS可以將樣本中的可揮發(fā)分子進(jìn)行分離，并且同時對樣本進(jìn)行性質(zhì)和量化的檢測。由于GC-MS技術(shù)可以鑒定樣品的具體組成成分，進(jìn)而提供關(guān)于樣品組成的定性和定量信息，因此可將CRC患者與健康對照組進(jìn)行代謝特征對比，從而尋找有意義的生物學(xué)標(biāo)志物差異。該技術(shù)具有高效的優(yōu)點(diǎn)，但因其高成本限制了其在臨床中推廣應(yīng)用。

1.2.2 選擇性離子流管質(zhì)譜法(SIFT-MS)： 是一種定量選擇質(zhì)譜技術(shù)，可以實(shí)時測量潮濕空氣樣品中微量氣體分子的濃度。該技術(shù)的原理是質(zhì)譜法與選擇離子流管耦合，基于微波放電產(chǎn)生的前體離子(H3O+，NO+和O2+)誘導(dǎo)化學(xué)電離并由四極質(zhì)譜儀進(jìn)行選擇。首先使用四極質(zhì)譜法選擇它們的分析順序，以微波放電產(chǎn)生前體離子，然后以預(yù)定的順序用前體離子誘導(dǎo)化學(xué)電離反應(yīng)，對待分析樣品中的VOC進(jìn)行電離分析。分析過程中前體離子和VOC在流管中相互作用并進(jìn)入第二個四極質(zhì)譜儀，通過掃描研究者定義的特定質(zhì)荷比(m/z)值范圍來完成實(shí)時數(shù)據(jù)分析，并且可以根據(jù)前體和產(chǎn)物離子信號比率實(shí)時計(jì)算微量化合物的絕對濃度[20]。與GC-MS相比，因該技術(shù)分離的VOC較少，所以提供的關(guān)于VOC組成詳細(xì)信息較GC-MS少，不能確定分子種類。但該技術(shù)無需樣品預(yù)處理或標(biāo)準(zhǔn)混合物校準(zhǔn)，具有實(shí)時測量，較低的維護(hù)成本，無需專業(yè)人員操作的優(yōu)點(diǎn)[21]。

表1 各種VOC檢測技術(shù)及特點(diǎn)概覽

注：GC-MS.氣相色譜-質(zhì)譜法；SIFT-MS.選擇性離子流管質(zhì)譜法；eNose.電子鼻

1.2.3 電子鼻技術(shù)(electronic-nose technology,eNose):eNose技術(shù)源于犬類嗅覺，eNose技術(shù)不能識別單個VOC，但它可以檢測到不同化學(xué)類別(如烷烴、醇類和芳香族化合物)的組合。目前有不同種類的商用和定制eNose，各包含6～32個傳感器陣列，雖然其裝置多種多樣，但均有基于模式識別的共同點(diǎn)。E-Nose技術(shù)以使用模式識別的方式來識別特定狀態(tài)，具有操作簡便、測量速度快且低成本的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)的缺點(diǎn)是無法提供絕對校準(zhǔn)和計(jì)量資料，影響電子鼻在臨床工作中的運(yùn)用。

1.2.4 其他分析方法： Mozdiak等[22]首次運(yùn)用氣相色譜—離子遷移率光譜法(GC-IMS)聯(lián)合非對稱場離子遷移率光譜法(FAIMS)分析CRC患者尿液標(biāo)本中的VOC，結(jié)果顯示，與糞便隱血試驗(yàn)(FOBT)相比，該方法具有更高的測試準(zhǔn)確性和更高的敏感度，ROC曲線下面積(AUC)達(dá)98%(目前該方法在VOC檢測中的研究和應(yīng)用較少)。

2 VOC在CRC早期診斷中的應(yīng)用

2.1 尿液中VOC在CRC早期診斷中的應(yīng)用 尿液中代謝產(chǎn)物濃度高、易收集的特點(diǎn)使其成為研究CRC中VOC良好的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。Silva等[23]用GC-MS法對比了33例癌癥患者(包括白血病14例，CRC患者12例和淋巴瘤患者7例)和21例健康人尿液標(biāo)本中82種VOC成分，結(jié)果表明，有18種VOC成分在2組間存在顯著差異，包括己醛、2-甲基-3-苯基-2-丙烯醛(+)、對異丙基苯(+)、苯甲醚(+)、4-甲基苯酚(+)、1,2-二氫-1,1,6-三甲基萘(+)等，首次將尿液標(biāo)本VOC檢測應(yīng)用于CRC診斷的研究。Westenbrink等[24]收集了39例CRC患者、35例腸易激綜合征患者及18例健康人的尿液標(biāo)本進(jìn)行VOC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VOC篩查CRC的敏感度和特異度分別為78%、79%。Arasaradnam等[25]分析83例CRC患者與50例健康人尿液標(biāo)本中的VOC，該研究中VOC分析診斷CRC的敏感度和特異度分別為88%、60%。

2.2 糞便中VOC在CRC早期診斷中的應(yīng)用 糞便作為直接反映腸道菌群改變及腸道細(xì)胞代謝改變的人體排泄物，同樣也具有研究價值[26]。De Meji等[27]利用eNose技術(shù)首次分析糞便標(biāo)本中的VOC，通過檢測157例試驗(yàn)對象(40例CRC患者，60例晚期腺瘤，57例健康人)的糞便標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CRC患者糞便標(biāo)本中的VOC成分與健康人存在顯著差異；該方法對CRC和晚期腺瘤診斷的敏感度分別為85%和62%，特異度分別為87%和86%，并且具有良好的重復(fù)性。試驗(yàn)中FIT檢測對CRC和晚期腺瘤診斷的特異度均為100%，敏感度分別為63%和7%。 SIFT-MS技術(shù)同樣可用于檢測糞便樣品中的VOC，并且已經(jīng)在相關(guān)研究中應(yīng)用[15]。Bond等[28]對137例試驗(yàn)對象(60例健康對照者，56例腺瘤性息肉患者，21例結(jié)直腸癌患者)糞便中162種VOC成分進(jìn)行檢測，丙-2-醇的濃度在癌癥組患者中明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 丙-2-醇作為標(biāo)志物預(yù)測CRC的AUC為0.76。當(dāng)聯(lián)合3-甲基丁酸作為診斷標(biāo)志物時，AUC可達(dá)0.82，敏感度和特異度分別為87.9%和84.6%。結(jié)果表明VOC檢測較英國目前臨床應(yīng)用的CRC糞便生物標(biāo)志物檢測具有更高的準(zhǔn)確性。

2.3 血液/血清中VOC在CRC早期診斷中的應(yīng)用 呼出氣體中VOC檢測的準(zhǔn)確性容易受到肺部疾病、吸煙、飲食、環(huán)境暴露等因素的影響[29]。血漿作為循環(huán)全身的內(nèi)環(huán)境，機(jī)體對包括腫瘤在內(nèi)的各種刺激所產(chǎn)生的VOC改變在進(jìn)入呼出氣體前可首先體現(xiàn)在血液中。檢測血液/血清生物標(biāo)志是篩查、診斷疾病應(yīng)用已久的經(jīng)典方法。代謝組學(xué)和檢測技術(shù)的發(fā)展使得檢測血液/血清中VOC用于疾病診斷成為可能。Wang等[30]研究了36例試驗(yàn)對象(16例CRC患者，20例健康人)血液標(biāo)本中VOC成分的改變，基于GC-MS研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者血液中3種VOC(苯基甲基氨基甲酸酯，乙基己醇和6-叔丁基-2,2,9,9-四甲基-3,5-癸二烯-7-炔)的含量顯著降低(P<0.01)，1種(1,4,4-四甲基-2,5-二甲基-環(huán)己烷)顯著升高(P<0.05)。

2.4 呼出氣體VOC在CRC早期診斷中的應(yīng)用 呼出氣體對于疾病的診斷價值早已被證實(shí)[31]，近年來國外研究發(fā)現(xiàn)，呼出氣體VOC檢測在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤的診斷中具有重要臨床意義[32-34]。國內(nèi)研究主要集中在VOC檢測對于肺部疾病的診斷，研究證實(shí)該技術(shù)在肺癌、慢性阻塞性肺疾病及下呼吸道感染病原菌的診斷中具有臨床意義[35-37]。Amal等[38]研究表明，丙酮和乙酸乙酯的濃度在CRC組中升高，呼出氣體VOC檢測診斷CRC的敏感度、特異度和準(zhǔn)確性可分別達(dá)到85%、94%和91%。Marker等[39]對150例研究對象(100例健康對照組，50例CRC患者)進(jìn)行呼出氣體的VOC檢測，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙醛可作為特異性VOC標(biāo)志物，其對CRC診斷的敏感度和特異度分別為96%和76%，對CRC復(fù)發(fā)診斷的敏感度和特異度為71.4%和90.9%。這些研究證明了呼出氣體VOC檢測對CRC早期篩查及監(jiān)測復(fù)發(fā)的重要意義。

3 VOC研究方向展望

3.1 VOC分析的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化 盡量避免因方法學(xué)的差異而產(chǎn)生偏差，同時也需要對最佳檢測條件(如樣本的選擇、樣本的溫度、濕度、pH等)進(jìn)行摸索，以減少檢測誤差，提高可重復(fù)性。VOC生物樣品的選擇需考慮操作的簡便性、樣本的可及性、患者的依從性及經(jīng)濟(jì)成本等，對于提高患者篩查率至關(guān)重要。

3.2 VOC檢測技術(shù)的改進(jìn)和創(chuàng)新 在癌癥篩查計(jì)劃中，篩查手段的性價比具有重要意義。目前VOC檢測的平均費(fèi)用是FIT的數(shù)十倍，同樣高于結(jié)腸鏡的檢查價格。高昂的檢測費(fèi)用及對儀器設(shè)備的要求使VOC檢測較難被接受，因此目前國內(nèi)尚無關(guān)于CRC診斷方面的VOC研究。因此，便捷、低廉的儀器開發(fā)將會更快推動VOC檢測在CRC診斷上的應(yīng)用。

3.3 VOC檢測腫瘤標(biāo)志物的統(tǒng)一性 目前對CRC篩查尚無統(tǒng)一的VOC標(biāo)志物，尋找特異度和敏感度較高的VOC腫瘤生物標(biāo)志物成為研究的關(guān)鍵。多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)證明，VOC與疾病之間的關(guān)系常反映在某一類別VOC，主要為飽和烴類(烷烴)、不飽和烴類、含氧類有機(jī)化合物、含硫類有機(jī)化合物和含氮類有機(jī)化合物，而非單獨(dú)某一種VOC。但是由于學(xué)者在考察VOC檢測對CRC的診斷作用時所用標(biāo)本不同，儀器設(shè)備不同，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法不同等，導(dǎo)致分析結(jié)果不盡相同。所以尚需更全面地開展臨床研究，收集足夠數(shù)據(jù)來確定統(tǒng)一的VOC腫瘤標(biāo)志物。

3.4 VOC檢測對于治療和預(yù)后評估的作用 目前國內(nèi)外VOC檢測多用于疾病的診斷與鑒別診斷，關(guān)于VOC檢測與藥物治療效果及預(yù)后之間的關(guān)系研究較少，這也是VOC檢測需要進(jìn)一步研究的方向。

4 小 結(jié)

CRC的早期篩查對于改善患者預(yù)后具有重要意義。理想的CRC篩選方法應(yīng)具有較好的依從性、敏感性和特異性，以及微創(chuàng)性和經(jīng)濟(jì)性。作為一種新型的CRC篩查方式，VOC具有創(chuàng)傷小或無創(chuàng)傷、依從性高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。同時，VOC篩查手段的發(fā)展仍面臨諸如檢測費(fèi)用高、操作流程未標(biāo)準(zhǔn)化、腫瘤標(biāo)志物未統(tǒng)一化等挑戰(zhàn)。但隨著該領(lǐng)域?qū)W者不懈努力及代謝組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，人們防癌意識的提高，VOC檢測技術(shù)有望成為CRC篩查及早期診斷的重要輔助手段。