冠心病合并腦血管狹窄與血漿氧化三甲胺水平的關(guān)系

楊升華，任素芬，劉嘯塵，熊筱偉，李晶津，楊承志，胡宏宇，陳威，郭彩霞，陳步星

近年來，腸道菌群已成為研究熱點(diǎn)，很多疾病的發(fā)生與腸道菌群密切相關(guān)[1-2]。Wang 等[3]首先證實(shí)，攝入富含膽堿、磷脂酰膽堿和左旋肉堿的食物（如豬、牛、羊肉等紅肉類）后，膽堿、磷脂酰膽堿和左旋肉堿進(jìn)入腸道，在腸道菌群的作用下可代謝為三甲胺（TMA），三甲胺入血后在肝臟被黃素單加氧酶氧化成氧化三甲胺（TMAO）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，TMAO 不僅可以降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)[4]，還可以通過改變血小板依賴性鈣信號(hào)，促進(jìn)血小板高反應(yīng)性并增強(qiáng)體內(nèi)血栓形成[5]，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[3-7]。越來越多臨床研究證實(shí)，TMAO 不僅與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度密切相關(guān)[8]，而且高血漿TMAO水平已成為心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立預(yù)測因子[9-10]。冠心病與腦血管狹窄病變具有相同的危險(xiǎn)因素，然而冠心病合并腦血管狹窄與血漿TMAO水平之間的關(guān)系，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 資料與方法

研究對(duì)象：連續(xù)選取2013 年10 月至2016 年6月期間首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者，同時(shí)滿足以下納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）擬診斷冠心病和（或）缺血性腦血管疾病患者，且同時(shí)接受冠狀動(dòng)脈造影及全腦血管造影；（2）年齡≥18 歲；（3）入組前1 個(gè)月內(nèi)未接受抗生素治療；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性心肌梗死；（2）伴有其他嚴(yán)重心血管疾病如主動(dòng)脈夾層、重度主動(dòng)脈瓣狹窄和肥厚型心肌病等；（3）急性腦卒中；（4）左心室射血分?jǐn)?shù)＜50%；（5）嚴(yán)重肝腎功能不全；（6）血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影及腦血管造影結(jié)果，將入組患者分為對(duì)照組（無冠心病及腦血管狹窄）、冠心病組、腦血管狹窄組、冠心病合并腦血管狹窄組。冠心病定義為至少存在一支主要冠狀動(dòng)脈血管狹窄或其分支≥50%；腦血管狹窄定義為頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈、大腦后動(dòng)脈、基底動(dòng)脈、椎動(dòng)脈中至少有一支血管狹窄程度≥50%。根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共入選158 例患者，并依據(jù)檢查結(jié)果分為4 組：對(duì)照組（無冠心病及腦血管狹窄病變，n=20）、冠心病組（n=25）、腦血管狹窄組（n=17）和冠心病合并腦血管狹窄組（n=96）。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并批準(zhǔn)，且所有納入研究對(duì)象均已簽署書面知情同意書。

血TMAO 水平的檢測：以EDTA 抗凝管采集患者空腹血液4～5 ml，3 000 r/min 超速離心后獲得血漿，凍存于-80℃冰箱中待統(tǒng)一檢測。檢測時(shí)取血漿50 μl，加入200 μl 內(nèi)標(biāo)物d9-TMAO 甲醇溶液（5 μmol/L），渦旋1 min，在4℃、15 000 r/min 離心25 min，取上清液2 μl 進(jìn)行檢測。按照質(zhì)譜檢驗(yàn)方案檢測血漿TMAO、左旋肉堿、膽堿、甜菜堿水平。流動(dòng)相為A：B=80%：20%，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水液，流動(dòng)相B為甲醇；流速：0.5 ml/min；氣體：氮?dú)狻Ｙ|(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：多反應(yīng)檢測掃描d9-TMAO m/z：85/66；TMAO m/z：76/58；正離子模式。所有色譜數(shù)據(jù)均按照峰面積由Analyst 提供的化學(xué)工作站計(jì)算所得。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以Kolmogorov-Smirow test 檢測正態(tài)性，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；偏態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，TMAO 呈偏態(tài)分布，經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后為正態(tài)分布，對(duì)照組、冠心病組、腦血管狹窄組、冠心病合并腦血管狹窄組之間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異變量再行LSD 法兩兩比較。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（%）表示，采用Fisher精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)性分析法分別分析冠心病組、冠心病合并腦血管狹窄組Gensini 評(píng)分與TMAO、左旋肉堿、膽堿、甜菜堿水平的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

四組患者臨床基線資料比較（表1）：四組患者在年齡、性別、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓、血脂水平、血肌酐、血尿酸等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），而在既往吸煙史、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）史、既往糖尿病史、口服藥物[阿司匹林、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ACEI/ARB）、β 受體阻滯劑]、Gensini 評(píng)分，與對(duì)照組相比，冠心病合并腦血管狹窄組均有更高比例（P均＜0.05）。四組左旋肉堿、膽堿、甜菜堿血漿水平差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組與冠心病合并腦血管狹窄組中位TMAO 水平均明顯高于對(duì)照組（P均＜0.001）。

表1 四組患者臨床基線資料比較（±s）

表1 四組患者臨床基線資料比較（±s）

注：PCI：經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；ACEI：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑；ARB：血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑；*：用中位數(shù)(四分位數(shù))表示。與對(duì)照組相比△P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

各組間TMAO 水平比較（圖1）：經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，冠心病組及冠心病合并腦血管狹窄組TMAO 水平均明顯高于對(duì)照組[（0.93±0.39）μmol/L vs （0.97±0.40）μmol/L vs （0.57±0.36）μmol/L，P＜0.01]，但兩組相比卻差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.682）。腦血管狹窄組TMAO 水平低于冠心病組[（0.65±0.36）μmol/L vs （0.93±0.39）μmol/L，P=0.019]與冠心病合并腦血管狹窄組[（0.65±0.36）μmol/L vs （0.97±0.40）μmol/L，P=0.002]，而與對(duì)照組相比差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.582）。

圖1 四組患者血漿氧化三甲胺水平的比較

冠心病組及冠心病合并腦血管狹窄組血漿TMAO 水平與Gensini 評(píng)分的關(guān)系：分別將冠心病組、冠心病合并腦血管狹窄組Gensini 評(píng)分分為低、中、高三等分。結(jié)果顯示，冠心病組中高Gensini 評(píng)分患者TMAO 水平高于低Gensini 評(píng)分患者（P=0.009），見圖2A；但在冠心病合并腦血管狹窄組中，高Gensini 評(píng)分患者與低Gensini 評(píng)分患者的TMAO 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.666），見圖2B。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在冠心病組，TMAO 水平與Gensini 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.569，P=0.009），左旋肉堿水平與Gensini 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.700，P=0.001），膽堿、甜菜堿水平與Gensini 評(píng)分未見明顯相關(guān)；在冠心病合并腦血管狹窄組，TMAO、左旋肉堿、膽堿、甜菜堿血漿水平均未見與Gensini 評(píng)分明顯相關(guān)。

圖2 冠心病組（2A）及冠心病合并腦血管狹窄組（2B）患者血漿TMAO 與Gensini 評(píng)分的關(guān)系

3 討論

已有較多研究表明，血漿TMAO 水平與心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈劑量依賴正相關(guān)[9]，本團(tuán)隊(duì)既往研究也發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈易損斑塊患者血漿TMAO 水平更高[11]。盡管冠心病與腦血管狹窄部分危險(xiǎn)因素相同，但目前TMAO 與腦血管疾病尤其動(dòng)脈粥樣硬化所致腦血管狹窄病變之間的關(guān)系相關(guān)研究甚少。冠心病合并腦血管狹窄患者是否比單獨(dú)冠心病或腦血管狹窄病變患者血漿TMAO 水平更高，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病合并腦血管狹窄患者血漿TMAO 水平高于腦血管狹窄患者，但未明顯高于冠心病患者，并且發(fā)現(xiàn)腦血管狹窄患者TMAO 水平未高于無冠心病無腦血管狹窄者。

既往研究表明，血漿TMAO 水平不僅與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度有關(guān)，而且與心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。Senthong 等[8]對(duì)353 例穩(wěn)定性冠心病患者進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，血漿TMAO 水平與SYNTAX 評(píng)分正相關(guān)。本研究則發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者中，血漿TMAO 水平與Gensini 評(píng)分正相關(guān)，提示TMAO 水平與冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度正相關(guān)。此外，Stubbs 等[12]在104 例慢性腎病患者中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，TMAO 水平與冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化程度正相關(guān)。Mafune 等[13]發(fā)現(xiàn)，TMAO 水平與梗死冠狀動(dòng)脈支數(shù)正相關(guān)。Tang 等[14]通過對(duì)4 007 例行冠狀動(dòng)脈造影的患者隨訪3 年發(fā)現(xiàn)，增加的TMAO 水平與主要不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。Li等[15]利用Cleveland 隊(duì)列（n=530）及Swiss 急性冠狀動(dòng)脈綜合征隊(duì)列（n=1 683）研究發(fā)現(xiàn)，血漿TMAO對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者1 個(gè)月、6 個(gè)月、12 個(gè)月乃至7 年的心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均有預(yù)測價(jià)值。相似地，Senthong 等[16]對(duì)2 235 例穩(wěn)定冠心病患者隨訪5 年發(fā)現(xiàn)，血漿TMAO 水平越高，長期死亡風(fēng)險(xiǎn)越高。多項(xiàng)薈萃分析[9-10，17]均提示，高TMAO 水平與未來心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。本研究也比較了TMAO 前體左旋肉堿、膽堿、甜菜堿在各組間的差異，但未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且在冠心病組，膽堿、甜菜堿與Gensini 評(píng)分無明顯相關(guān)性，這與既往研究相似[18]。日本的一項(xiàng)研究[19]發(fā)現(xiàn)，膽堿及甜菜堿的攝入與心血管疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)。薈萃分析[18]顯示，TMAO 前體膽堿及甜菜堿攝入與心血管病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)。

與預(yù)期相反，本研究發(fā)現(xiàn)，較單純腦血管狹窄組相比，冠心病合并腦血管狹窄患者未見更高的TMAO 水平，并且腦血管狹窄患者血漿TMAO 水平未高于對(duì)照組。Yin 等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，缺血性腦卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者血漿TMAO 水平非但無升高，反而出現(xiàn)下降。CARDIA研究[21]顯示，血漿TMAO 水平與10 年冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生率、冠狀動(dòng)脈鈣化進(jìn)展及頸動(dòng)脈中膜厚度均無明顯相關(guān)性。同樣地，Skagen 等[22]研究未發(fā)現(xiàn)頸部動(dòng)脈粥樣硬化與TMAO 水平明顯相關(guān)。但有研究表明，TMAO 水平與缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。Nie等[23]在一項(xiàng)巢式病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，TMAO 水平與高血壓患者腦卒中首次發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。Liang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，TMAO 水平是心房顫動(dòng)患者發(fā)生缺血性腦卒中的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。Wu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，TMAO 水平是頸動(dòng)脈支架置入術(shù)后新發(fā)缺血性腦損傷的預(yù)測因素。目前關(guān)于TMAO 與腦血管疾病尤其腦血管狹窄所致缺血性腦卒中的關(guān)系尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。合并腦血管狹窄的冠心病患者其血漿TMAO 水平未較冠心病患者更高的可能原因：（1）腦血管狹窄尤其是缺血性腦卒中可能改變了腸道菌群組成[26]，腸道菌群改變可能影響血漿TMAO 水平；（2）合并腦血管狹窄時(shí)飲食改變可能影響了腸道菌群[27]，從而影響了TMAO 水平；（3）臨床用藥不同可能影響了腸道菌群[28]，從而干擾了TMAO 與腦血管狹窄之間的關(guān)系。

本研究有一定局限性：樣本量不夠大，未能除外藥物的影響，缺乏隨訪。TMAO 是致病因素還是標(biāo)志物尚不明確[29]，降低TMAO 有害還是獲益[30-31]，TMAO 對(duì)于腦血管疾病診治是否具有臨床價(jià)值等一系列問題，都需要大規(guī)模及長期隨訪的前瞻性研究來深入探討。