二仙湯防治骨質(zhì)疏松癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

王明亮 閆小龍 田思勝

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2. 日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東 日照 276800 3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

隨著世界人口老齡化程度的增高，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率也在逐年上升[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精、主骨生髓，骨的生長發(fā)育有賴于腎中精氣的滋養(yǎng)與推動(dòng)[2-3]，腎精不足則骨缺乏滋養(yǎng)。二仙湯是臨床上治療OP的經(jīng)典名方[4]，其中仙茅、淫羊藿、巴戟天溫補(bǔ)腎陽，滋補(bǔ)腎精；佐以知母、黃柏滋補(bǔ)腎陰、瀉腎火；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，調(diào)理沖任為使藥[5]，全方補(bǔ)腎壯陽藥與滋陰瀉火藥并用，適合用于陰陽俱虛的復(fù)雜癥侯[6]。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，二仙湯能有效防治OP，改善OP患者以及OP模型動(dòng)物骨密度、骨小梁厚度[7-8]，提高體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖能力和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨轉(zhuǎn)化[9]。但是，中藥復(fù)方化學(xué)成分多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜以及有效成分不確定等因素的存在，使中藥復(fù)方作用機(jī)理的研究受到了限制，二仙湯治療OP的具體分子機(jī)制尚未清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)基礎(chǔ)上通過網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)綜合觀察藥物對(duì)疾病的干預(yù)與影響，與中醫(yī)學(xué)整體觀念理論相契合，能夠?qū)χ兴帍?fù)方及方中化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析[10-12]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)中藥經(jīng)典名方二仙湯治療OP的分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，為中藥復(fù)方治療機(jī)制的研究提供科學(xué)可靠的方法。

1 材料和方法

1.1二仙湯中活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, 版本2.3, http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)能分析所含化合物的藥物動(dòng)力學(xué)(ADME：absorption，distribution，metabolism，excretion)的相關(guān)參數(shù)，包括口服吸收利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)、Caco-2細(xì)胞滲透性、半衰期、血腦屏障、脂水分布系數(shù)等[13]。本研究分析二仙湯有效活性成分時(shí)，設(shè)定篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18；同時(shí)應(yīng)用TCMSP預(yù)測(cè)活性成分的作用靶點(diǎn)[14]。

1.2二仙湯“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建

將獲得的二仙湯活性成分、活性成分作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape(版本3.7.1，https://cytoscape.org/)軟件中，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”，應(yīng)用network analyzer計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)參數(shù)以分析二仙湯中重要的成分和靶點(diǎn)。

1.3OP發(fā)病相關(guān)基因篩選

本研究以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索網(wǎng)絡(luò)已知公共疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，包括TTD (Therapeutic Target Database，更新至2017.09.15, http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/); DrugBank 數(shù)據(jù)庫 (版本5.1.4, https://www.drugbank.ca/); OMIM數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man, https://www.omim.org/); GAD databases (Genetic Association Database,更新至2014.08.18, https://geneticassociationdb.nih.gov/)；PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/); DisGeNET 數(shù)據(jù)庫 (版本6.0, http://www.disgenet.org/home/)，刪除各數(shù)據(jù)庫中重復(fù)靶點(diǎn)，獲得已知的OP發(fā)病靶點(diǎn)。

GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個(gè)由基因表達(dá)數(shù)據(jù)、芯片和微陣列組成的公共功能基因組數(shù)據(jù)庫。以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索GEO數(shù)據(jù)庫，篩選獲得GSE56116數(shù)據(jù)集，包含腎陰虛組樣品4個(gè)(GSM1356155，GSM1356157，GSM1356158，GSM1356161)，腎陽虛組樣本3個(gè)(GSM1356160，GSM1356163，GSM1356164)，非腎虛組樣本3個(gè)(GSM1356156，GSM1356162，GSM1356165)，對(duì)照組樣品3個(gè)(GSM1356159，GSM1356166，GSM1356167)。利用R語言 limma包分析芯片數(shù)據(jù)的差異基因，篩選條件設(shè)定為P值<0. 05，差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>2。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘核心調(diào)控基因、深入了解疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫(版本11.0，https://string-db.org/)[15]對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合得分大于0.4的交互作用被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)，采用Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，運(yùn)用自由度(degree，DC)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)等指標(biāo)進(jìn)行篩選，其中DC值、BC值、CC值大于所有節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)平均值的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)。

1.5關(guān)鍵作用靶點(diǎn)KEGG和GO富集分析

表 1 預(yù)測(cè)出靶點(diǎn)活性成分的基本信息Table 1 Basic informaiton for predicting target active components

注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID, 版本6.8, https://david.ncifcrf.gov/)[16]是一個(gè)在線生物信息數(shù)據(jù)庫，用于從高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)生成的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集中了解高級(jí)功能[17]和注釋基因的生物學(xué)過程[18]。為了分析關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能，采用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1二仙湯活性成分篩選與ADME分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選二仙湯中6味中藥入血的活性成分，其中仙茅7個(gè)，淫羊藿23個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，巴戟天20個(gè)，黃柏27個(gè)，知母15個(gè)，刪除重復(fù)成分，得到84個(gè)活性成分。二仙湯各味中藥中符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的成分比例圖，見圖1。

圖1 二仙湯活性成分ADME參數(shù)分布Fig.1 ADME parameter distribution of active components in Erxian decoction

2.2二仙湯“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建二仙湯活性性成分和作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以尋找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，確定二仙湯有效成分中發(fā)揮重要作用的成分和靶點(diǎn)。結(jié)果如圖2和表1所示，構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中，共有84個(gè)活性成分，21個(gè)活性成分采用TCMSP預(yù)測(cè)出145個(gè)作用靶點(diǎn)。

圖2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Traditional Chinese Medicine-active component-target network diagram

紅色菱形代表中藥，綠色倒三角代表預(yù)測(cè)出靶點(diǎn)的活性成分，綠色正方形代表未預(yù)測(cè)出靶點(diǎn)的活性成分，藍(lán)色圓形代表作用靶點(diǎn)，圓形大小代表degree值的大小，圓形越大表示degree值越大

2.3OP相關(guān)致病靶點(diǎn)

疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫中GAD、TTD、OMIM、DrugBank、PharmGKB和DisGeNET分別檢索到275、27、94、48、5和426個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)，共納入691個(gè)與OP發(fā)生發(fā)展相關(guān)的已知靶點(diǎn)。

圖3 基于GSE56116芯片OP致病靶點(diǎn)的聚類圖和火山圖Fig.3 Clustering map and volcano map of OP pathogenic targets based on GSE56116 chip

利用limma包分析GEO芯片數(shù)據(jù)庫中GSE56116數(shù)據(jù)集，共找出84個(gè)變化最為明顯的基因，其中上調(diào)表達(dá)的有70個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有14個(gè)，這些基因可能與OP致病密切相關(guān)。差異表達(dá)基因見聚類圖(圖3 A)和火山圖(圖3B)所示。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過二仙湯活性成分作用靶點(diǎn)與OP致病靶點(diǎn)直接映射，獲得關(guān)鍵作用靶點(diǎn)40個(gè)，如圖4所示。采用String構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖5所示，共有40個(gè)節(jié)點(diǎn)，278個(gè)相互作用關(guān)系。通過DC值、BC值和CC值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浜Y選，獲得核心節(jié)點(diǎn)9個(gè)，見表2。

表2 二仙湯治療OP核心靶點(diǎn)的基本信息Table 2 Basic information of Erxian decoction in treating OP core targets

圖4 OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選圖Fig.4 Screening of OP key targets

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Key target protein interaction network

圖5中，節(jié)點(diǎn)的大小代表節(jié)點(diǎn)的自由度(degree)，節(jié)點(diǎn)越大表示degree值越大；線條表示各個(gè)靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，條線粗細(xì)表示相互作用關(guān)系的緊密程度，線條越粗表示相互作用越緊密。

2.5關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG和GO富集分析

應(yīng)用DAVID對(duì)上述關(guān)鍵基因進(jìn)行功能富集分析。GO分析結(jié)果表明，關(guān)鍵基因富集的生物學(xué)過程變化在RNA聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)作用(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、序列特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控(positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity)等，見圖6 A。關(guān)鍵基因富集細(xì)胞組分主要為細(xì)胞外間隙，胞外區(qū)，核漿和質(zhì)膜等，見圖6B。分子功能主要富集在酶結(jié)合(enzyme binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、甾體結(jié)合(steroid binding)，見圖6C。KEGG通路分析結(jié)果所示，關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的非疾病命名信號(hào)通路主要富集在TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)，低氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)，雌激素信號(hào)通路(Estrogen signaling pathway)，血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)等通路過程，見圖6D和表3。

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析圖注：A 生物學(xué)進(jìn)程，B 細(xì)胞組分，C 分子功能，D KEGG信號(hào)通路。Fig.6 Enrichment analysis plot of key targets

KEGG分析結(jié)果如表3所示，TNF信號(hào)通路富集基因數(shù)目及P值均較為顯著，分析其可能為二仙湯治療OP的重要途徑。其具體作用機(jī)制可能是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥活動(dòng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、細(xì)胞粘附和細(xì)胞存活等過程，發(fā)揮治療OP的作用，見圖7。

表3 OP相關(guān)基因的KEGG分析Table 3 KEGG analysis of OP-related genes

圖7 TNF信號(hào)通路中富集基因具體作用機(jī)制圖Fig.7 Specific mechanism of enriched genes in TNF signaling pathway

3 討論

由于全球人口老齡化，估計(jì)OP的發(fā)病率將在未來20年翻一番，給公共衛(wèi)生服務(wù)造成沉重的負(fù)擔(dān)[19]。目前西藥治療OP療效顯著[20]，但是藥物治療的不良反應(yīng)和長期依從性差的問題未得到有效解決[21]。中草藥治療骨病已有幾千年的歷史，具有不良反應(yīng)少，療效顯著的特點(diǎn)，受到越來越多的應(yīng)用[22]，但是具體的分子機(jī)制尚未清楚。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出二仙湯的活性成分及作用靶點(diǎn)，檢索OP的致病靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并映射核心靶點(diǎn)，進(jìn)行核心靶點(diǎn)的KEGG分析和GO富集分析，結(jié)果顯示，TNF信號(hào)通路、低氧因子誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路和雌激素受體信號(hào)通路可能為二仙湯治療OP的關(guān)鍵途徑。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，具有與其他組織相同的遺傳基礎(chǔ)[23]，BMSCs的增殖和分化是成骨的關(guān)鍵[24]。炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和干擾素-γ(IFN-γ)也可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[25]。TNF-α是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，通過激活多種信號(hào)通路和分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[26]。Lu等[27]證明，由于轉(zhuǎn)錄因子核因子κ-α(NF-κB)的激活，TNF-α抑制了成骨細(xì)胞與前體細(xì)胞的分化，降低了RUNX 2和成骨細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)的表達(dá)，抑制了維生素D刺激的轉(zhuǎn)錄。Hess等[28]研究表明，TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs中BMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦物質(zhì)化。

缺氧對(duì)多種組織和細(xì)胞類型的影響主要由HIF-1介導(dǎo)[29]，其中HIF-1α在骨發(fā)育和再生過程中起著重要作用。HIF-1α通路是適應(yīng)低氧反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，這一途徑調(diào)控血管生成基因如VEGF、血管生成素等[30]。骨髓腔和骨骺生長板的骨內(nèi)膜區(qū)都是缺氧區(qū)，HIF-1α信號(hào)通路控制著這些區(qū)域的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的功能[31]。研究結(jié)果表明，在發(fā)育中的成骨細(xì)胞中激活HIF-1α通路，增強(qiáng)了VEGF介導(dǎo)的骨血管形成，增加了骨的生成[32]。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的對(duì)臨床常用中藥復(fù)方二仙湯治療OP的分子機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，揭示了二仙湯可能是通過TNF信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路治療OP，為中藥復(fù)方的推廣應(yīng)用以及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了理論依據(jù)。