毛蕊花糖苷與99Tc-MDP聯(lián)合治療糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松的效果及其分子機(jī)制研究

孫玉蘭 刁云鵬 孫偉 王琳 李禾 李淼 王萍 馮英霞 徐巖 宮宇 王青

1. 大連市友誼醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，遼寧 大連116000 2. 大連醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis) 是指各種原因?qū)е碌墓墙M織微結(jié)構(gòu)破壞，骨質(zhì)脆性增加，進(jìn)而引發(fā)骨折的一種代謝性的骨骼系統(tǒng)的疾病[1]，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腰背疼痛、身長(zhǎng)縮短以及易發(fā)生骨折等，嚴(yán)重影響了患者的身體健康以及生活質(zhì)量，目前我國(guó)的老年人中的患病比例已經(jīng)超過(guò)50%[2]。因此，有效預(yù)防骨質(zhì)疏松非常重要。

骨質(zhì)疏松癥按病因分類(lèi)，主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，而繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的眾多引發(fā)因素里，糖皮質(zhì)激素引發(fā)的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIO)最為常見(jiàn)[3-4]。

雙膦酸鹽是破骨細(xì)胞的強(qiáng)有力的抑制劑，臨床應(yīng)用超過(guò)15年，其對(duì)于骨質(zhì)疏松癥以及其他病理性骨折等有很好的防治作用，但是其可以導(dǎo)致患者頜骨發(fā)生壞死[5]。從臨床療效觀察來(lái)看，目前對(duì)于糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松癥防治方法效果均不佳，不能有效預(yù)防骨折的發(fā)生。

锝(99Tc)亞甲基雙膦酸鹽(99-Technetium-methylene diphosphonate,99Tc-MDP)對(duì)骨組織具有良好靶向性，能夠治療由于骨質(zhì)丟失造成的骨質(zhì)疏松[6]。目前，99Tc-亞甲基雙膦酸鹽在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等其他自身免疫性疾病及骨科相關(guān)疾病。但是其對(duì)于GIO的預(yù)防作用的研究仍然罕見(jiàn)[7]。

毛蕊花糖苷(Ver)是一種典型的苯乙醇苷，可顯著增加成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[8]，并可抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟[9]。這些表明Ver可能有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。然而，目前尚不清楚Ver能否保護(hù)骨骼免受糖皮質(zhì)激素的傷害。因此，本研究旨在探討Ver對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨量丟失的改善作用，并闡明潛在的分子機(jī)制。

Koh等[10]報(bào)道FLT3在絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥和隨后的骨折中發(fā)揮作用。 此外，F(xiàn)LT3已被證明在破骨細(xì)胞分化和功能中起關(guān)鍵作用[11]。泛素特異性肽酶(ubiquitin-specific protease, USP)10是泛素特異性蛋白酶(USP)家族的成員。Weisberg等[12]證實(shí)USP10是穩(wěn)定FLT3所需的關(guān)鍵的去泛素化酶，并且抑制USP10可誘導(dǎo)FLT3蛋白的降解。

本課題通過(guò)基礎(chǔ)研究探討毛蕊花糖苷及99Tc-亞甲基二膦酸鹽在預(yù)防糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松過(guò)程中潛在的藥理協(xié)同作用，并進(jìn)一步分析USP10/FLT3的作用及其意義。

1 材料和方法

1.1試劑與儀器

地塞米松磷酸鈉注射液由濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，5 mL/支，(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H37021224)、99Tc-亞甲基雙膦酸鹽由成都云克藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，劑型分為A、B劑：A劑(液體)含99锝量為5 μg/mL，B劑(凍干粉劑)內(nèi)含亞甲基雙膦酸鈉5 mg，氯化亞錫0.5 mg(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字：H20000218)；毛蕊花糖苷購(gòu)自大連美侖生物試劑公司；骨密度儀(GE Lunar PRODIGY型，美國(guó))；萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(島津AG，日本)。

1.2動(dòng)物模型

48只雌性SD大鼠(200±20)g由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，大鼠可以自由采食水和食物。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。將SD大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)；其他4組大鼠接受肌肉注射地塞米松磷酸鈉(1 mg/kg)，每周2次，制作骨質(zhì)疏松模型；在Dex造模1 h后，Ver組灌胃給予Ver(30 mg/kg),99Tc-MDP治療組大鼠尾靜脈注射5 mg/kg99Tc-MDP，聯(lián)合治療組大鼠灌胃Ver同時(shí)，尾靜脈注射5 mg/kg99Tc-MDP，每周2次，連續(xù)給藥8周。造模成功后老鼠常規(guī)喂養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，骨密度測(cè)定，同時(shí)確定是否造模成功，腹主動(dòng)脈放血處死并取材備用。

1.3骨密度測(cè)定

雙能X線吸收法(dual-energy X-ray absorption, DXA)骨密度儀進(jìn)行掃描，掃描的部位包括全身、腰椎體及股骨。每次掃描時(shí)使鼠處于俯臥位，后肢維持在外旋位，股骨與脛骨呈90°角。

1.4生物力學(xué)參數(shù)測(cè)定

剔除左側(cè)股骨肌肉及軟組織，分別在萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。支點(diǎn)跨距選擇18 mm；以中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，加載速率設(shè)置5.0 mm/min；溫度23 ℃；周?chē)鷿穸?0%～70%，測(cè)出各組大鼠股骨的最大載荷、彈性載荷、彈性位移及彈性模量等參數(shù)。

1.5血清生化指標(biāo)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫分析法，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)血液中骨形成指標(biāo)：骨鈣素(osteocalcin)及I型原膠原N-端肽(procollagen type I N-terminal propeptide)；骨吸收指標(biāo)：I型膠原交聯(lián)C-末端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen)。

1.6Western blot 檢測(cè)

將股骨頭組織用液氮預(yù)冷，取出稱(chēng)重后研磨至粉末狀，50 mg 骨組織加200 μL RIPA 裂解液制備樣品。根據(jù)BCA的程序測(cè)定蛋白(BCA)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)(20 μg)用含有β-巰基乙醇的電泳樣品緩沖液和預(yù)制的10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在37 ℃條件下，用含有5%脫脂牛奶的Tris緩沖液[含0.1% Tween-20(TBST)]封閉膜2 h。之后用1∶1000稀釋的一抗USP10，F(xiàn)LT3以及β-肌動(dòng)蛋白抗體在4 ℃過(guò)夜孵育。隨后用TBST洗滌，然后用第二抗體孵育。再用TBST充分洗滌后，將膜暴露在增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)下。用Biospectrum-410多光譜成像系統(tǒng)和化學(xué)HR相機(jī)410記錄發(fā)出的光。在透射紫外光下觀察和拍攝蛋白條帶。使用image-pro plus 軟件進(jìn)行半定量分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組的數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組比較采用單因素方差分析。在所有的統(tǒng)計(jì)分析中，P<0.05或P<0.01都可表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Ver及99Tc-MDP改善Dex導(dǎo)致的大鼠體重及股骨干重的下降

結(jié)果如表1所示，模型組大鼠體重增加明顯要低于正常對(duì)照組大鼠；但相對(duì)于模型組，各治療組大鼠體重均增長(zhǎng)明顯。同時(shí)，糖皮質(zhì)激素能使大鼠骨干重明顯下降，而各治療組能明顯預(yù)防骨質(zhì)疏松癥大鼠骨干重的下降。

組別實(shí)驗(yàn)前體重實(shí)驗(yàn)后體重實(shí)驗(yàn)后股骨干重對(duì)照組(n=12)209.5±34.8254.1±32.30.49±0.05模型組(n=12)211.6±31.1&214.5±29.3?0.37±0.04?99Tc-MDP組(n=12)212.4±29.3#230.4±31.9#0.44±0.03#Ver 組(n=12)217.1±26.5#238.4±41.1#0.44±0.05#聯(lián)合組(n=12)214.5±37.2#237.3±34.2#0.47±0.04#

注: 與對(duì)照組比較，*P<0. 05; 與模型組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，&P>0.05。

2.2Ver及99Tc-MDP改善Dex導(dǎo)致的大鼠骨密度及骨生物力學(xué)參數(shù)的下降

通過(guò)DXA骨密度儀掃描(圖1)，結(jié)果如表2所示。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠全身、腰椎體及股骨骨密度明顯降低；而治療組均能使骨質(zhì)疏松癥大鼠各部位骨密度顯著升高。三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中，最大載荷、彈性模量、彈性位移和彈性載荷都有明顯降低(見(jiàn)表3)；而治療組均能改善糖皮質(zhì)激素所致的上述骨生物力學(xué)參數(shù)的下降。

圖1 雙能X線吸收法掃描模型大鼠全身骨密度(R1股骨；R2腰椎)Fig.1 Bone mineral density of rats in model group scanned with DEXA (R1: the femur; R2: the lumbar vertebrae)

組別全身骨密度腰椎體骨密度股骨骨密度對(duì)照組(n=12)0.164±0.0040.221±0.0040.182±0.007模型組(n=12)0.112±0.010?0.168±0.008?0.137±0.010?99Tc-MDP組(n=12)0.147±0.007#0.195±0.020#0.168±0.010#Ver 組(n=12)0.145±0.008#0.199±0.007#0.165±0.005#聯(lián)合組(n=12)0.158±0.006#0.207±0.010#0.178±0.010#

注: 與對(duì)照組比較，*P<0. 05; 與模型組比較，#P<0.05。

組別彈性模量/(MPa)最大載荷/(N)彈性載荷/(N)彈性位移/(mm)對(duì)照組(n=12)2563±125.6256±19.5208±17.60.45±0.02模型組(n=12)2131±148.6?177±35.1?131±26.3?0.33±0.02?99Tc-MDP組(n=12)2413±129.8#230±41.6#180±31.8#0.41±0.04#Ver 組(n=12)2387±164.8#223±41.8#177±35.2#0.39±0.04#聯(lián)合組(n=12)2477±159.4#241±44.5#181±28.7#0.42±0.04#

注: 與對(duì)照組比較，*P<0. 05; 與模型組比較，#P<0.05。

2.3Ver及99Tc-MDP改善Dex導(dǎo)致的大鼠骨代謝相關(guān)血液指標(biāo)異常

結(jié)果如表4 所示。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠骨形成指標(biāo)：骨鈣素明顯降低，PINP無(wú)明顯改變；骨吸收指標(biāo)：CTX-1同樣明顯降低；而治療組均能使上述骨代謝指標(biāo)顯著改善。

圖2 Ver對(duì)USP10、FLT3蛋白的表達(dá)的影響注：柱狀圖顯示了由β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后的各蛋白的相對(duì)表達(dá)比。與對(duì)照組比較，*P<0.05; 與模型組比較，&P>0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.2 Effect of Ver on the protein expressions of USP10 and FLT3 in GIO rats

組別BGPPINPCTX-1對(duì)照組(n=12)2011.6±133.185.3±7.148.3±6.8模型組(n=12)1571.5±114.2?83.7±10.239.2±7.2?99Tc-MDP組(n=12)1779.8±129.5#82.6±9.945.4±7.9#Ver 組(n=12)1784.6±122.8#83.5±11.545.6±6.5#聯(lián)合組(n=12)1809.3±131.5#84.8±13.247.4±7.1#

注: 與對(duì)照組比較，*P<0. 05; 與模型組比較，#P<0.05。

2.4Ver降低Dex導(dǎo)致的大鼠骨組織中USP10及FLT3的上調(diào)

Western blot結(jié)果(圖1)表明模型大鼠骨組織內(nèi)USP10和FLT3的表達(dá)比空白組明顯增加。而Ver組及聯(lián)合治療組均能使骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織中USP10/FLT3顯著降低。值得注意的是，兩Ver治療組之間USP10和FLT3的表達(dá)沒(méi)有顯著差異，而模型組與99Tc-MDP治療組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明99Tc-MDP并不影響USP10/FLT3信號(hào)通路，即Ver與99Tc-MDP治療GIO的分子機(jī)制不同。

3 討論

糖皮質(zhì)激素被廣泛用于治療炎癥及免疫調(diào)節(jié)紊亂性疾病。然而，長(zhǎng)期連續(xù)使用會(huì)導(dǎo)致如骨質(zhì)疏松、增加骨折風(fēng)險(xiǎn)等不良反應(yīng)[13-14]。雙膦酸鹽類(lèi)為目前在防治糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松藥物中療效最為顯著，能夠增加骨密度及降低脊柱骨折的風(fēng)險(xiǎn)，雙膦酸鹽類(lèi)藥物能夠?qū)μ瞧べ|(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松有預(yù)防與治療的效果。但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽可以導(dǎo)致頜骨壞死，這一現(xiàn)象稱(chēng)為雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨壞死。

而我國(guó)自主研發(fā)的新藥锝(99Tc)亞甲基雙膦酸鹽中的99Tc可通過(guò)清除自由基，調(diào)節(jié)免疫功能；另一方面，MDP作為雙膦酸鹽類(lèi)化合物，對(duì)骨組織尤其病變骨具有良好靶向性，主要被骨中羥磷灰石晶體吸附和與未成熟膠原結(jié)合，以修復(fù)病灶骨，同時(shí)它又能抑制破骨細(xì)胞活性，防止羥基磷灰石晶體溶解，抑制骨吸收。改變病骨細(xì)胞生存的微環(huán)境，抑制和修復(fù)骨病灶，防止病理性骨折。近年來(lái)99Tc-亞甲基雙膦酸鹽在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病及骨科疾病，并已取得了較好的效果，無(wú)明顯的下頜骨壞死及發(fā)熱等不良反應(yīng)，值得注意的是，盡管锝亞甲基雙膦酸鹽目前使用安全，但其具有一定的輻射，臨床應(yīng)注意患者安全使用。因此，有理由認(rèn)為99Tc-MDP對(duì)風(fēng)濕免疫疾病患者具有免疫抑制和預(yù)防骨質(zhì)疏松的雙重臨床意義。

在該研究中，成功建立GIO大鼠模型后，模型組大鼠的體重、股骨干重明顯降低，骨代謝相關(guān)血液指標(biāo)明顯異常，骨鈣素是成骨細(xì)胞特有的一種分泌蛋白，其血液含量可直接反映成骨細(xì)胞的活性，被認(rèn)為是骨形成或骨轉(zhuǎn)換過(guò)程中敏感的生化指標(biāo)[15-16]，在該研究中，GIO大鼠血液中的骨鈣素含量明顯降低，而另一種骨形成指標(biāo)PINP[17]并無(wú)明顯改變；CTX-1存在于成熟的骨膠原中，當(dāng)破骨細(xì)胞溶解骨膠原時(shí)被釋放，CTX-1是目前公認(rèn)骨吸收指標(biāo)[18]，而在該研究中，Dex導(dǎo)致模型大鼠CTX-1含量明顯降低，其機(jī)制有待研究。同時(shí)DXA骨密度測(cè)定提示大鼠全身、腰椎體及股骨骨密度均明顯降低；股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)彈性模量、最大載荷、彈性位移和彈性載荷都明顯降低；Western blot結(jié)果顯示，模型組骨組織中USP10及FLT3表達(dá)較對(duì)照組明顯增加。而經(jīng)過(guò)毛蕊花糖苷治療后，上述癥狀都明顯改善，99Tc-MDP聯(lián)合治療效果更佳明顯。同時(shí)值得注意的是，毛蕊花糖苷能夠使得GIO大鼠骨組織中 USP10/FLT3蛋白表達(dá)明顯降低，但99Tc-MDP治療組與模型組之間USP10/FLT3蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明Ver與99Tc-MDP治療GIO的分子機(jī)制不同。。

綜上，研究結(jié)果說(shuō)明，毛蕊花糖苷能抑制GIO大鼠USP10/FLT3通路的活性，降低USP10/FLT3的蛋白表達(dá)來(lái)改善Dex引起的大鼠骨質(zhì)疏松；而毛蕊花糖苷和99Tc-MDP治療GIO大鼠具有良好的藥理協(xié)同作用，并且是通過(guò)作用不同的分子靶點(diǎn)而完成的。