健骨顆粒含藥血清調(diào)控miR-141對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

張楚天 張文明,2 林燕萍* 魏振樸 楊娟 張志恒 孫攀 王志強(qiáng)

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122 2.河南省洛陽正骨醫(yī)院鄭州院區(qū)，河南 鄭州 450016 3.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122

骨質(zhì)疏松癥是一種發(fā)病廣泛而又隱蔽的退行性疾病，我國骨質(zhì)疏松患者近九千余萬，其發(fā)病誘因多樣而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見的病型，所占比例高達(dá)80%[1-2]。骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制是骨骼吸收-重建動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)引起全身骨量降低和骨骼細(xì)微結(jié)構(gòu)惡化[3]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓基質(zhì)內(nèi)具有多種分化潛能的干細(xì)胞，作為成骨細(xì)胞的來源細(xì)胞之一，是影響骨骼吸收-重建動(dòng)態(tài)平衡的重要因素。MiRNA是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的小分子RNA，在基因表達(dá)和傳遞中有著廣泛作用，當(dāng)敲除小鼠BMSCs內(nèi)一個(gè)miRNA合成必需的核酸內(nèi)切酶后，BMSCs失去成骨分化功能[4]，這一實(shí)驗(yàn)提示miRNA與成骨分化有著相關(guān)性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA在BMSCs分化的各個(gè)階段均有著不同的影響[5]。Runx2是BMP信號(hào)通路中的關(guān)鍵成骨轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)量被Dlx5及其同源異形基因Msx2共同調(diào)控，同時(shí)Runx2可以直接調(diào)控BMSCs細(xì)胞成骨分化[6]。課題組前期研究結(jié)果顯示：miR-141通過對(duì)Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控作用來影響B(tài)MSCs的成骨分化。本文基于以上基礎(chǔ)，使用傳統(tǒng)補(bǔ)腎健脾方劑健骨顆粒提取含藥血清干預(yù)去卵巢模型小鼠BMSCs，從miR-141及其下游Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)通路的角度出發(fā)，探究健骨顆粒影響B(tài)MSCs成骨分化的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

健骨顆粒組方：煅狗骨、山茱萸、淫羊藿等藥物。藥物原材料福建省藥材公司，成藥由福建中醫(yī)藥研究院中試車間加工制備，顆粒劑含原生藥比率2.9∶1。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

雌性C57小鼠10只(清潔級(jí))，4周齡，體重23±2 g，購至中科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(上海)，動(dòng)物合格證編碼：SCXK(滬)2013-0005，用于BMSCs細(xì)胞提取。雌性SD大鼠30只(SPF級(jí))，3月齡，體重265±20 g，購至中科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(上海)，動(dòng)物合格證編碼：SCXK(滬)2012-0002，用于含藥血清制備。以上動(dòng)物均飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室(合格證編碼：閩SYXK 2009-0001)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑

青/鏈霉素、胰蛋白酶、PBS緩沖液由Hyclone公司提供，胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基由Gibco公司提供，CD29、CD34、CD44、CD45單克隆抗體由Abcam公司提供，茜素紅由Sigma公司提供，ALP檢測(cè)試劑盒由南京建成公司提供，Dlx5、Msx2、Runx2抗體由Santa Cruz公司提供，β-actin、鼠二抗、兔二抗、TRIZOL由北京全氏金生物技術(shù)有限公司提供，封閉液、5×蛋白上樣緩沖液、一抗稀釋液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、SDS-PAGE電泳緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PMSF、RIPA、 Beyo plus超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit由大連寶生物公司提供。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器

倒置相差顯微鏡由TKO光學(xué)儀器株式會(huì)社提供，流式細(xì)胞儀由BD公司提供，Q-PCR儀由美國ABI公司提供。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1含藥血清制備：30只三月齡大鼠，分別健骨顆粒和生理鹽水灌胃1周，通過大鼠體重按2 g/kg計(jì)算藥量，生理鹽水每日灌服量為2 mL。腹主動(dòng)脈采全血后3 000 r/min離心15 min取上層血清，56 ℃水浴30 min，過濾除菌，-20 ℃冷凍備用。

1.5.2BMSCs細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定：卵巢切除法造摸，microCT三維圖像采集分析骨質(zhì)疏松指標(biāo)數(shù)據(jù)確認(rèn)小鼠建模成功后取雙側(cè)股骨，α-MEM培養(yǎng)基(10% FBS)沖出骨髓，制備單細(xì)胞懸液置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，待細(xì)胞鋪滿瓶底后棄培養(yǎng)液以1.25%胰酶消化傳代，鏡下觀察BMSCs形態(tài)變化。取第三代BMSCs制成單細(xì)胞懸液，加入抗體上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.3含藥血清誘導(dǎo)BMSCs分化情況：取第3代BMSCs加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(β-磷酸甘油10 μmol/L、地塞米松10 μmol/L、維生素C 50 μmol/L、10% FBS)和10%濃度的含藥血清和空白血清成骨誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)后第3、8、13天鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化；第8天，行ALP染色及定量；第13天，茜素紅染色檢測(cè)鈣鹽結(jié)節(jié)分布情況。

1.5.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-141及DLx5、Msx2、Runx2的基因表達(dá)情況：成骨誘導(dǎo)第3代BMSCs，第13天提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后與相應(yīng)的引物(如表1)結(jié)合，上機(jī)，反應(yīng)均為20 μL體系。以U6作為miR-141的內(nèi)參，β-actin作為Runx2、Dlx5、Msx2 mRNA的內(nèi)參，校正各組樣品后對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

1.5.5Western blot檢測(cè)DLx5、Msx2、Runx2的蛋白表達(dá)情況：提取BMSCs總蛋白并用BCA法測(cè)取蛋白濃度，每泳道上樣蛋白樣品和預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，電泳，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移膠上蛋白到PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后將膜浸入封閉液，搖床上孵育2 h。加入一抗4 ℃過夜，取出PVDF膜，浸入TBST搖洗3次。加入二抗室溫下孵育1 h，取出PVDF膜，浸入TBST搖洗3次。顯影，使用Image Pro-plus program version 5.0圖象分析系統(tǒng)分析條帶。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞表型鑒定

BMSCs表型鑒定結(jié)果(見圖1)：CD29(88.8%)、CD44(94.3%)表達(dá)陽性；CD34(1.54%)、CD45(1.04%)表達(dá)陰性。

圖1 BMSCs細(xì)胞表型鑒定結(jié)果Fig.1 BMSCs cell phenotypic identification results

2.2BMSCs成骨分化結(jié)果

第2天，兩組細(xì)胞數(shù)量均稀少且無明顯差異，細(xì)胞形狀呈梭形或不規(guī)則形；第4天，兩組細(xì)胞數(shù)量有所增加，且些許細(xì)胞出現(xiàn)成對(duì)核，細(xì)胞形狀為圓形或不規(guī)則形的多核細(xì)胞出現(xiàn)，空白血清組多核細(xì)胞出現(xiàn)較少；第6天，細(xì)胞數(shù)量密集，含藥血清現(xiàn)成群的細(xì)胞開始聚集且在群落中散布有結(jié)晶顆粒，而空白血清組細(xì)胞數(shù)量明顯低于含藥血清組，且細(xì)胞群落間結(jié)晶群稀疏(見圖2)。

圖2 BMSCs成骨分化結(jié)果Fig.2 BMSCs osteogenic differentiation results

成骨誘導(dǎo)后第8天進(jìn)行ALP染色，空白血清為淺藍(lán)色，含藥血清組顯示藍(lán)紫色(見圖3)。ALP定量檢測(cè)顯示，含藥血清組的ALP定量結(jié)果顯著高于空白血清組(P<0.05)。第13天行茜素紅染色，染色后有深紅色鈣化結(jié)節(jié)散布，但空白血清組鈣化結(jié)節(jié)較少，呈點(diǎn)狀分布，無大的鈣化結(jié)節(jié)；含藥血清組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，呈珠狀廣泛分布，有大面積的甚至成片連接的鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)(見圖4)。

圖3 ALP染色及定量結(jié)果注： a 空白血清組； b 含藥血清組；與空白血清組比較，*P<0.05。Fig.3 ALP staining and quantitative results

圖4 茜素紅染色結(jié)果Fig.4 Alizarin red staining results

2.3RT-PCR檢測(cè)成骨基因表達(dá)結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)miR-141及Dlx5、Msx2、Runx2的基因表達(dá)情況(見表2)：含藥血清組和空白血清組比較，含藥血清組miR-141及Msx2的基因表達(dá)較空白血清組明顯下降(P<0.01)，Dlx5、Runx2的基因表達(dá)顯著升高(P<0.01)。

表2RT-PCR檢測(cè)成骨基因表達(dá)結(jié)果

Table2Detection of osteogenic gene expression results by RT-PCR

組別miRNA-141Dlx5Msx2Runx2空白血清組1.0001.0001.0001.000含藥血清組0.500±0.021??2.390±0.106??0.330±0.014??3.620±0.241??

注：與空白血清組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.4Western blot檢測(cè)成骨蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot檢測(cè)成骨誘導(dǎo)第13天DLx5、Msx2和Runx2蛋白表達(dá)情況：含藥血清組Msx2較空白血清組稍有下降(P<0.05)，而Dlx5和Runx2的蛋白表達(dá)相對(duì)升高(P<0.01)，三者的蛋白變化情況與RT-PCR結(jié)果基本一致(見圖5，表3)。

圖5 Western blot檢測(cè)成骨蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of osteogenic protein expression results

表3Western blot檢測(cè)成骨蛋白表達(dá)結(jié)果

Table3Western blot analysis of osteogenic protein expression results

組別Dlx5Msx2Runx2空白血清組0.330±0.0120.800±0.0250.532±0.046含藥血清組0.430±0.019??0.498±0.096?0.830±0.043??

注：與空白血清組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

BMSCs作為成骨細(xì)胞的主要來源細(xì)胞之一在骨質(zhì)疏松的研究中有著至關(guān)重要的地位，雌激素降低影響著BMSCs的命運(yùn)，其成骨分化降低導(dǎo)致骨量丟失是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制，因此BMSCs可以作為闡釋補(bǔ)腎健脾類中藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松機(jī)理的切入點(diǎn)[7]。中藥或復(fù)方水提取液干預(yù)體外細(xì)胞是中藥研究的常用方法，但是這種方法的嚴(yán)謹(jǐn)性目前存在爭(zhēng)議，主要矛盾集中于藥物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物不確定性和藥物成分自身的復(fù)雜性，這兩點(diǎn)的存在會(huì)一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。含藥血清就是對(duì)以上不足的改進(jìn)，通過模擬體內(nèi)代謝的方法減少了實(shí)驗(yàn)的誤差，使實(shí)驗(yàn)更加科學(xué)[9]。miRNA是維持干細(xì)胞特征和特性的關(guān)鍵遺傳因子[10]，對(duì)干細(xì)胞生長和分化的各個(gè)階段有著綜合性的調(diào)節(jié)作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)miR-141-3P作為Wnt靶基因通過Wnt通路抑制人間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[12]，同時(shí)課題組前期研究也明確了miR-141與BMP/Smad信號(hào)通路及骨代謝中間的關(guān)聯(lián)[13]。因此，以miRNA為“鑰匙”來揭示中醫(yī)藥抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理成為了當(dāng)前研究的重心[14]。

流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法鑒定提取的BMSCs細(xì)胞顯示：造血干細(xì)胞及白細(xì)胞表型的CD 34、CD 45表達(dá)為陰性，細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞表型的CD 29、CD 44表達(dá)均呈陽性，既全骨髓培養(yǎng)法提取的細(xì)胞滿足實(shí)驗(yàn)需要。課題組前期研究表明，健骨顆粒有促進(jìn)成骨分化的功效，且含藥血清濃度為10%時(shí)干預(yù)效果最佳，該功效歸因于健骨顆粒的類植物雌激素樣作用[15]。此類作用在成骨分化的多個(gè)階段均有體現(xiàn)，ALP染色及定量的實(shí)驗(yàn)中含藥血清組明顯優(yōu)于空白血清組，同時(shí)茜素紅染色結(jié)果同ALP染色結(jié)果一致，進(jìn)一步印證健骨顆粒的促成骨分化作用。該作用可能歸功于健骨顆粒組方中淫羊藿、煅狗骨、山茱萸等補(bǔ)腎壯骨中藥，朱曉峰等[16]通過研究傳統(tǒng)補(bǔ)腎陽中藥淫羊藿發(fā)現(xiàn)，其主要藥理成分淫羊藿苷在體內(nèi)可代謝為淫羊藿素，淫羊藿素可以發(fā)揮類雌激素樣作用激活BMP/Smad信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Smads蛋白作為胞內(nèi)信號(hào)傳遞的中介因子，是BMP 信號(hào)傳動(dòng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵一環(huán)，Smads蛋白整合多種不同信號(hào)進(jìn)而轉(zhuǎn)換成一種總的效應(yīng)來調(diào)節(jié)目標(biāo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。BMP與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)Co-Smad與Phosho-R-Smad形成復(fù)合物后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合于DNA序列上，協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，促進(jìn)Dlx5表達(dá)，而Dlx5增高可以激活Runx2的表達(dá)[18]，而這一系列反應(yīng)中的共激活因子可能就是miR-141類的短基因片段[19]。RT-PCR結(jié)果顯示，含藥血清組miR-141及Msx2的基因表達(dá)量明顯低于空白血清組，而Dlx5、Runx2的基因表達(dá)結(jié)果剛好相反，Western blot檢測(cè)結(jié)果同RT-PCR結(jié)果一致，說明健骨顆粒可以通過影響miR-141表達(dá)水平來調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化，即健骨顆粒的類雌激素作用可以抑制miR-141的表達(dá)，從而降低miR-141對(duì)Dlx5表達(dá)的抑制，高表達(dá)的Dlx5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力增強(qiáng)，相對(duì)地降低了其同源異形基因Msx2對(duì)Runx2表達(dá)的抑制作用，Runx2表達(dá)水平升高促進(jìn)BMSCs成骨分化。

總之，健骨顆粒可以通過抑制BMSCs中miR-141的內(nèi)源性表達(dá)水平來緩解去卵巢早期雌激素急劇下降導(dǎo)致的Dlx5/Msx2降低，進(jìn)而調(diào)高的Runx2表達(dá)，促進(jìn)成骨分化，達(dá)到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的。