慢性腎衰患者褪黑素水平、氧化應(yīng)激、炎癥水平與骨密度相關(guān)性研究

徐志平 聞純 王麗

1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教研室，江蘇 鹽城 224005 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腎臟內(nèi)科，寧夏 銀川 750004

骨質(zhì)疏松(OP)是全身骨骼系統(tǒng)的一種臨床常見病，以骨組織的微結(jié)構(gòu)損傷和低骨量為特征，患者易發(fā)生骨折[1]。慢性腎功能衰竭(CRF)的維持性血液透析(MHD)會(huì)出現(xiàn)感染、心血管疾病和OP等多種并發(fā)癥。MHD患者OP發(fā)生率高達(dá)40%～60%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。MHD患者常有氧化應(yīng)激(OS)和微炎癥狀態(tài)，晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)是反映機(jī)體OS狀態(tài)的指標(biāo)之一，丙二醛(MDA)是OS的終末代謝產(chǎn)物，可作為反映機(jī)體OS水平的指標(biāo)；炎癥狀態(tài)主要表現(xiàn)為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)水平的升高[3]。褪黑素(melatonin，MT)是松果體分泌的一種激素，它不僅具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)睡眠的作用，而且通過多種途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化，與OP密切相關(guān)[4]。本研究通過檢測(cè)慢性腎功能衰竭患者血液中MT、AOPP、丙二醛、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)的水平，分析它們是否參與OP的發(fā)生及其與BMD的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1一般材料

本研究納入了2016年5月至2019年2月期間在我院長(zhǎng)期接受MHD治療的CRF患者94名。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性腎功能衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；②接受MHD超過3個(gè)月的患者；③簽署知情同意書的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重心臟、腦或肝臟疾病或伴有精神疾病的患者；②惡性腫瘤患者，孕婦或哺乳期婦女。根據(jù)是否涉及骨質(zhì)疏松癥，入選患者分為骨質(zhì)疏松組(觀察組，n=49)和非骨質(zhì)疏松組(對(duì)照組，n=45)。兩組間的基線數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(表1)。所有患者均使用血液透析機(jī)(Fresenius，Oberursel，德國)，將雙腔導(dǎo)管置于頸部或右股靜脈的右側(cè)以建立心肺分流術(shù)；稀釋置換液(上海長(zhǎng)征藥業(yè)有限公司，中國上海)使用負(fù)壓超濾泵和低分子量肝素(天津大通藥業(yè)有限公司，天津，中國，批準(zhǔn)號(hào)NMPN H20020469)用于抗凝(第一劑量3 000U，加入500U/h，置換率4.0 L/h)，血流量保持在約200 mL/min。患者每次治療4 h，每周接受3次透析。該研究得到了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者和/或監(jiān)護(hù)人簽署了書面知情同意書。

1.2指標(biāo)檢測(cè)

使用雙能X射線骨密度計(jì)(深圳XRAY電氣有限公司，中國深圳)測(cè)量腰椎(L1-L4)BMD，圖形分析區(qū)域分為總腰椎區(qū)域；計(jì)算T值。OP的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①正常骨量：T值>-1；②骨量減少：T值=-1至-2.5；③OP：T值<-2.5。通過ELISA分析血清AOPP，炎癥因子(TNF-α，IL-6和IL-1)和MT的水平，并通過TBA檢測(cè)MDA水平。從患者收集靜脈血5 mL(禁食8 h后的早晨7:00)，立即分離血清并置于-80 ℃冰箱中備用。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量血清AOPP、MT、TNF-α、IL-6和IL-1的水平。相關(guān)試劑盒由上海恒源生物科技有限公司(中國上海)提供，操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。將樣品(1倍稀釋)和100 μL酶標(biāo)記的溶液加入到反應(yīng)板的微孔中，在37 ℃下孵育90 min。將板洗滌3次(每?jī)纱伍g隔15 s)后，加入顯色劑A和B(各50 μL)，在室溫，20 ℃，黑暗中培養(yǎng)15 min。使用酶標(biāo)儀(深圳SinoThinker Technology Co.，Ltd.，Shenzhen，China)在15 min內(nèi)450 nm波長(zhǎng)下讀取OD值。然后計(jì)算AOPP、MT、TNF-α、IL-6和IL-1的水平。通過硫代巴比妥酸(TBA)測(cè)定法檢測(cè)血清MDA。將MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京，中國)中的試劑A通過水浴加熱至透明，加入340 mL雙蒸水并均勻混合到試劑B中并在4 ℃下儲(chǔ)存。在試劑C被60 mL雙蒸水(95 ℃)完全溶解后，加入60 mL冰醋酸，混合均勻并在4 ℃下避光保存。將標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物(10 nmol / mL四乙氧基丙烷)儲(chǔ)存在4 ℃。操作步驟：①將標(biāo)準(zhǔn)品(1 mL)加入標(biāo)準(zhǔn)管中，將血清(0.1 mL)加入試管中，并將無水乙醇加入標(biāo)準(zhǔn)空白管中；②加入試劑A(0.1 mL)并均勻混合到標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白試管和試管中，然后加入試劑B(0.1 mL)；③將試劑C(0.1 mL)加入標(biāo)準(zhǔn)管，試管和標(biāo)準(zhǔn)空白管中，并將50%冰醋酸(0.1 mL)加入試驗(yàn)空白管中；④使用旋流混合器將溶液均勻混合，用保鮮膜擰緊管口，刺穿一個(gè)冒口，然后將管浸入熱水(95 ℃)中40 min并在流水下冷卻；⑤以2 000×g離心10 min后，取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)532 nm的OD值，計(jì)算血清中MDA的水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用t檢驗(yàn)；計(jì)量數(shù)據(jù)以比率表示，并使用卡方檢驗(yàn)。Pearson的相關(guān)系數(shù)用于相關(guān)性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者氧化應(yīng)激和MT水平的比較，如表2所示；觀察組AOPP和MDA水平顯著高于對(duì)照組，但MT水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

兩組患者炎癥因子水平的比較，如表3所示；觀察組TNF-α，IL-6和IL-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

腰椎骨密度和T值比較，如表5所示。觀察組中腰椎的BMD和T值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

氧化應(yīng)激，炎癥和MT水平與BMD的相關(guān)性分析如圖1所示，Pearson相關(guān)分析顯示AOPP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1水平與BMD呈負(fù)相關(guān)，但MT與BMD呈正相關(guān)(P<0.05)。

表1 兩組患者的基線數(shù)據(jù)Table 1 Baseline characteristics of patients in the two groups

表2兩組患者氧化應(yīng)激和MT水平的比較

Table2Comparisons of oxidative stress and MT level between the two groups of patients

組別nAOPP (μmol/L)MDA (nmol/L)MT(pg/mL)觀察組對(duì)照組4945 108.95±15.1343.69±9.06 5.97±1.472.73±0.8619.76±3.3824.43±3.27t值P值25.091<0.00112.894 <0.001 6.797<0.001

表3兩組患者炎癥因子水平的比較(ng/L)

Table3Comparisons of inflammatory factor levels between the two groups of patients (ng/L)

組別nTNF- αIL-6IL-1觀察組對(duì)照組49 45 49.98±3.15 37.83±3.04 53.48±3.35 41.45±3.23 47.28±3.1935.39±3.17t值P值18.996 <0.001 17.693 <0.001 18.106<0.001

表4腰椎骨密度(BMD)和T值的比較

Table4Comparisons of lumbar spine bone mineral density (BMD) and T-score

組別nBMD (g/cm2)T值觀察組對(duì)照組4945 0.73±0.120.91±0.13-3.75±0.93-1.03±0.86t值P值 6.981 <0.001 14.683<0.001

3 討論

OP是由骨代謝紊亂(骨吸收大于骨形成)引起的，其特征在于每單位體積的骨質(zhì)量減少和骨脆性增加，并且它將持續(xù)發(fā)展并且容易導(dǎo)致骨折[5]。臨床上，BMD通常用于OP診斷。骨骼系統(tǒng)中松質(zhì)骨(60%～75%)集中在人體腰椎，因此MHD患者腰椎BMD的測(cè)量可以反映骨礦物質(zhì)含量的早期變化。此外，松質(zhì)骨的骨轉(zhuǎn)換率高于皮質(zhì)骨，對(duì)各種代謝刺激更敏感。此外，其骨量積累將比皮質(zhì)骨更早達(dá)到峰值，因此腰椎BMD的測(cè)量具有更高的敏感性[6]。過去，人們認(rèn)為CRF患者伴隨OP的機(jī)制是患者體內(nèi)鈣磷代謝紊亂降低了體內(nèi)維生素D的水平，從而導(dǎo)致代謝性酸中毒和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)。近年來，隨著研究的深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到接受長(zhǎng)期MHD的CRF患者的骨代謝將由多種激素和細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致OPG/RANKL系統(tǒng)在體內(nèi)的異常表達(dá)水平和功能障礙，最終影響破骨細(xì)胞的分化和功能并誘導(dǎo)OP[7]。 MT是松果體分泌的一種吲哚神經(jīng)內(nèi)分泌激素，也是目前已知的最強(qiáng)的自由基清除劑[8]。研究表明，CRF患者的MT分泌明顯低于正常人群，尤其是夜間MT峰值消失的MHD患者[9]。人體正常狀態(tài)下具有完善的抗氧化機(jī)制，它可以通過酶催化和無酶催化消除氧自由基，從而起到抗氧化作用[10]。當(dāng)體內(nèi)防御系統(tǒng)功能低下時(shí)，氧化還原反應(yīng)將失去平衡，導(dǎo)致活性氧(ROS)的積累，氧化和抗氧化之間的不平衡，其中氧化占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致OS[11]。AOPP是OS狀態(tài)下白蛋白產(chǎn)生的一種雙精氨酸蛋白質(zhì)交聯(lián)劑。MDA是一種有毒物質(zhì)，由體內(nèi)超氧陰離子對(duì)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的過氧化作用產(chǎn)生[12]。

表5氧化應(yīng)激，炎癥和MT水平與BMD的相關(guān)性分析

Table5Correlation analysis of oxidative stress, inflammation and MT level with BMD

變量r值P值變量r值P值TNF-αIL-6 IL-1 -0.487-0.401-0.417 -0.401 -0.417 -0.406 AOPP MDA MT -0.406 -0.424 0.439 -0.424 0.439 0.015

圖1 AOPP、MDA、TNF-α、IL-6、IL-1和MT水平與BMD的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of AOPP, MDA, TNF-α, IL-6, IL-1 and MT levels with BMD

本研究結(jié)果顯示觀察組MT水平顯著低于對(duì)照組，但AOPP和MDA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，表明CRF患者OP具有明顯的氧化-抗氧化系統(tǒng)不平衡，因?yàn)锳OPP不僅來自ROS，而且也是OS的結(jié)果。此外，MDA具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，會(huì)引起大分子(蛋白質(zhì)、脂類和核酸)的交聯(lián)聚合，其含量直接反映了脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度，可以作為指標(biāo)。自由基損傷的嚴(yán)重程度，間接反映了氧自由基損傷的過程。降低的MT水平可能與OS有關(guān)，并且在CRF患者中與OP相互作用。CRF患者的蛋白尿和高腎素-血管緊張素活性可刺激機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能并導(dǎo)致免疫功能障礙[13]。TNF-α是一種重要的單核炎癥因子，IL-6是白細(xì)胞介素家族的一員，也是急性期反應(yīng)中的淋巴細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮多種作用[14]。此外，IL-1也是白細(xì)胞介素家族的重要成員之一，包括IL-1α和IL-1β，其中IL-1β是炎癥過程中重要的炎性細(xì)胞因子之一[15]。本研究結(jié)果顯示，觀察組TNF-α、IL-6和IL-1水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，提示CRF患者的微炎癥更為明顯。

本研究結(jié)果顯示，AOPP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1水平與BMD呈負(fù)相關(guān)，但MT與BMD呈正相關(guān)(P<0.05)，因?yàn)樽銐虻腗T會(huì)減少形成和激活骨痂，從而抑制骨吸收并增加骨量[16]。此外，MT可誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素的分泌，其協(xié)同應(yīng)用可促進(jìn)新骨的形成。但隨著MHD的擴(kuò)展，患者容易發(fā)生松果體鈣化；鈣化面積越大，MT分泌越少，患者更容易發(fā)生OP，這表明MT與OP呈負(fù)相關(guān)。炎癥因子，如TNF-α、IL-6和IL-1，通常表現(xiàn)出促進(jìn)骨吸收和抑制骨形成的作用；特別地，TNF-α可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)并刺激破骨細(xì)胞活化。IL-1可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，使骨吸收大于骨形成并誘導(dǎo)OP[17]。當(dāng)氧化劑-抗氧化功能在體內(nèi)不平衡時(shí)，它將抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞的礦化并誘導(dǎo)其死亡。AOPP通過激活NF-κB途徑抑制成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖和分化。此外，MDA可以抑制蛋白質(zhì)和核酸合成，降低酶活性，導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化物質(zhì)減少，從而逐漸減少骨量。OS刺激破骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化后，破骨細(xì)胞反過來會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，加劇對(duì)體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制的破壞并形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致廣泛的OP[18]。

總之，MHD患者易患OP，并且存在顯著的OS和炎癥狀態(tài)；患者的MT水平，OS和炎癥程度與OP密切相關(guān)。臨床探討其關(guān)系對(duì)降低接受MHD的CRF患者OP的發(fā)生率具有重要意義。