甲狀旁腺激素聯(lián)合降鈣素對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨生長因子的影響

鮑根強 肖春來 張國輝 李華 趙曉亮 王泉

哈勵遜國際和平醫(yī)院手足外科，河北 衡水 053000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量骨密度降低，骨組織微結(jié)構(gòu)退化，骨強度下降，骨組織脆性增加，骨折危險性增大為特點的全身性骨骼疾病[1]。骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)作為其最嚴重的并發(fā)癥，OP不僅增加了患者發(fā)生骨折的風險，也使得骨折愈合更加困難[2]。目前，臨床治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括激素調(diào)節(jié)藥物、加速骨形成藥物、促進骨礦化藥物等，這些藥物對治療OP有一定的療效，但也伴隨嚴重的不良反應[3]。而甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素防治OP以其安全、不良反應小等特點，在治療上有較大優(yōu)勢。骨折修復愈合需要相關骨生長因子的參與和調(diào)節(jié)。因此，本研究探討甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素對骨質(zhì)疏松性骨折骨生長因子及骨折愈合的影響，為臨床藥物治療OPF提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗試劑與材料

SPF級健康雌性SD大鼠75只，3月齡，體重(320±30)g，訂購于北京中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所(合格證號SCXK京2017-002)。重組人甲狀旁腺素(1-34)(100 μg/支，批號：J201708072，美國Sigma公司)，鮭降鈣素注射液(密蓋息)(50 IU/支，批號：1609045，瑞士諾華制藥有限公司)，柜式X線照片機購置于美國美國Hologic公司，雙能X線骨密度測定儀購于美國GE公司，ELISA檢測試劑盒訂購于武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、胰島素生長因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體均購于武漢博士德生物有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組與藥物干預

實驗按隨機數(shù)字法分為：假手術組、去勢組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組，假手術組僅切除部分脂肪組織，其他3組均行雙側(cè)卵巢切除術。4周后各組均行右側(cè)股骨干閉合性骨折髓內(nèi)固定術。于術后第2 d分別給予不同藥物干預，假手術組、去勢組：皮下注射0.9% NaCl 5 mL/kg，1次/d；甲狀旁腺素組：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d；降鈣素組：皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d；聯(lián)合用藥組：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d，皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d，連續(xù)用藥8周。SD大鼠飼養(yǎng)SPF級屏障環(huán)境。

1.2.2構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型

參照駱陽等[4]構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型與內(nèi)固定方法。各組大鼠均分籠飼養(yǎng)，標準飼料，自由飲水，照明、通風、溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境條件均相同。

1.2.3組織標本處理

攝片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法處死大鼠，打開胸腔，左心室采血3～5 mL，3 000 r/min，離心15 min，收取上層血清0.5～1 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。剝離取出右股骨，依次分離軟組織，拔出髓內(nèi)克氏針，保護骨痂組織。截取骨折端長約1～2 cm股骨痂，0.9% NaCl沖洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脫鈣6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5 μm連續(xù)組織切片，切片60 ℃烤箱4 h，取出室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4放射性(X線)檢查

術后6周各組選取15只SD大鼠進行X線攝片，觀察各組大鼠骨折端骨痂生長和骨折線模糊情況。放射學評估采用Warden等[5]的X線評分方法，依據(jù)骨折斷端表現(xiàn)進行骨折愈合評分。

1.2.5骨痂骨密度(BMD)和礦物含量(BMC)測定

取出待測右股骨骨痂，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測股骨痂，采用小物體掃描模式，以分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描速度60 mm/s，掃描寬度5.0 cm的參數(shù)值，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，檢測骨痂BMD和BMC值。

1.2.6血清生化指標水平測定

采用ELISA試劑盒檢測血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平，按照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.2.7HE染色

參照HE染色法實驗步驟進行操作[4]，光鏡下觀察染色并采集圖片。隨機選取5個視野，計數(shù)新生血管數(shù)，取平均值。

1.2.8免疫組織化學染色法

參照免疫組織化學染色法實驗步驟進行操作[6]，光學顯微鏡觀察并采集圖片。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，免疫組織化學染色結(jié)果采用平均光密度值(MOD)表示。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1各組骨折愈合及評分

假手術組骨折線模糊不清，骨折端有明顯骨痂包繞生長，連接緊密，骨密度增高，已達到臨床愈合；去勢組骨折線依然清晰可見，少量骨痂生長，未連接，骨折愈合欠佳；甲狀旁腺素和降鈣素組骨折線部分模糊，骨痂部分生長，部分連接緊密，骨痂塑形改造期；聯(lián)合用藥組骨折線模糊或消失，骨折端有連續(xù)性骨痂包繞貫穿，大量骨性骨痂形成，開始重建塑形，骨折處髓腔再通。假手術組、去勢組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組骨折愈合評分分別為：4.788±0.225、2.840±0.134、3.927±0.152、3.862±0.160、4.431±0.175。去勢組較假手術組骨折愈合評分顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組骨折愈合評分升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 X線觀察骨折愈合情況注：A 假手術組；B 去勢組；C 甲狀旁腺素組；D 降鈣素組；E 聯(lián)合用藥組Fig.1 X-ray observation of fracture healing

2.2各組骨痂BMD和BMC

去勢組較假手術組股骨BMD和BMC顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組股骨BMD和BMC增高，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P<0.05)。見表1。

組別nBMD/(g/cm2)BMC/(g)假手術組 150.215±0.0451.143±0.036去勢組 150.127±0.020?0.564±0.023?甲狀旁腺素組150.172±0.0270.980±0.025降鈣素組 150.166±0.0310.953±0.026聯(lián)合用藥組 150.195±0.046#1.127±0.030#

注：與假手術組比較，*P<0.05；與去勢組比較，#P<0.05。

2.3各組血清生化指標水平

去勢組較假手術組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見表2。

2.4各組骨痂組織學觀察

假手術組骨痂區(qū)大量骨小梁形成，生長旺盛，排列致密有序，交錯成網(wǎng)狀，成骨細胞數(shù)量較多，形成致密板層狀骨，周圍見骨髓腔再通。去勢組骨痂區(qū)骨小梁明顯減少，生長稀疏，間隙增寬不連續(xù)，排列紊亂，大量間充質(zhì)干細胞及纖維軟骨細胞，成骨細胞、新生微小血管少見。甲狀旁腺素組和降鈣素組骨痂區(qū)骨小梁較前增多，排列較規(guī)則，小梁周圍血管生成增多，成熟骨細胞及成骨細胞較前增多。聯(lián)合用藥組骨小梁多，生長旺盛，交錯網(wǎng)狀，排列致密有序，較多成熟的骨細胞及成骨細胞，局部見編織骨。

2.5各組蛋白表達

BMP-2主要表達于成骨細胞胞漿，VEGF主要表達于成骨細胞質(zhì)及少量成熟軟骨細胞內(nèi)，TGF-β主要表達于軟骨細胞、成骨細胞以及間充質(zhì)細胞，

表2 各組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平比較Table 2 Comparison of serum BMP-2, VEGF, TGF-β and IGF-1 levels in each group (μg/L,)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與去勢組比較，#P<0.05。

圖2 HE染色觀察骨痂的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200)注：A 假手術組；B 去勢組；C 甲狀旁腺素組；D 降鈣素組；E 聯(lián)合用藥組；a 骨小梁，b 軟骨細胞Fig.2 Morphological changes of bone callus was observed by HE staining (×200)

IGF-I主要表達于成纖維細胞、軟骨細胞以及成骨細胞。去勢組較假手術組BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1蛋白表達升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組骨痂組織BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1表達比較Table 3 Comparison of BMP-2, VEGF, TGF-β and IGF-1 expression in osteophytes of each group ()

注：與假手術組比較，*P<0.05；與去勢組比較，#P<0.05。

3 討論

OPF修復愈合是一個極其復雜有序的骨組織再生過程，涉及多種細胞和細胞因子參與調(diào)控，骨生長因子是指具有刺激骨細胞生長活性的因子，在骨折愈合過程中起重要調(diào)節(jié)和促進作用，細胞因子通過影響骨細胞的分化、增殖和成熟，刺激骨和軟骨形成，調(diào)節(jié)骨質(zhì)重建，參與骨折愈合的全過程[7]。

甲狀旁腺激素(PTH)是骨代謝過程中調(diào)節(jié)鈣磷代謝的重要調(diào)節(jié)因子，PTH(1-34)不僅刺激軟骨細胞增殖分化以及軟骨和纖維性骨痂形成，而且還能刺激前成骨細胞增殖、產(chǎn)生堿性磷酸酶及骨基質(zhì)蛋白，促進骨形成，使纖維性骨痂轉(zhuǎn)化為骨性骨痂[8]。同時，它也可以提高骨痂的生物機械性能，增加軟骨鈣化，加速骨折愈合[9]。降鈣素(calcitonin，CT)是調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素，CT能抑制破骨細胞的活性和減少破骨細胞的數(shù)量，從而抑制骨組織的自溶和吸收，減少骨骼中鈣和骨基質(zhì)的流失，抑制骨轉(zhuǎn)化，防止骨量丟失，提高骨密度[10]。此外研究表明CT不僅能作用于成骨細胞，刺激成骨細胞增殖和分化，而且還可阻止成骨細胞的凋亡，促進骨小梁的改建，促進骨折愈合[11]。本研究表明去勢組較假手術組骨折愈合評分、股骨BMD和BMC均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組骨折愈合評分、股骨BMD和BMC均升高，以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。去勢組骨痂骨小梁明顯減少，生長稀疏，排列紊亂，成骨細胞、新生微小血管少見。聯(lián)合用藥組骨小梁多，生長旺盛，排列致密有序，較多成熟的骨細胞及成骨細胞。同樣，劉海蔚等[12]研究表明PTH(1-34)聯(lián)合降鈣素能明顯增加腰椎BMD，升高骨轉(zhuǎn)換指標。金成春等[13]研究表明甲狀旁腺素聯(lián)合鮭魚降鈣素治療老年骨質(zhì)疏松合并Garden I股骨頸骨折是一種安全、療效更好的方法。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是骨折愈合的關鍵性細胞因子之一，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族中的一組多功能細胞因子，具有誘導未分化間充質(zhì)細胞增殖、分化成軟骨細胞和成骨細胞，介導軟骨、骨形成[14]。其中BMP-2的作用尤為顯著，BMP-2具有顯著促進間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為骨細胞的作用，促進骨折愈合。IGF-1是骨骼細胞分泌的重要生長因子，參與骨細胞生長、分化以及代謝的調(diào)節(jié)。IGF-1促成骨細胞及成軟骨細胞的分化和增殖，可刺激膠原合成促進骨基質(zhì)形成[15]。VEGF作為機體內(nèi)促進血管生長最主要的生長因子，在骨折修復過程中起著重要的的作用，此外VEGF通過對骨原細胞有直接作用，刺激成骨細胞分化，促進骨形成[16]。TGF-β屬于TGF超家族，TGF-β可刺激骨膜間充質(zhì)細胞增殖、分化，促進成骨和成軟骨細胞增生，刺激Ⅰ型膠原合成，誘導膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨過程，TGF-β還可促進骨痂形成并提高骨痂強度[17]。此外TGF-β還可促進分化的成骨細胞聚集活化，從而加速骨的修復和再生。本研究表明去勢組較假手術組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平和骨痂BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組血清水平和骨痂蛋白表達均升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。

綜上所述，甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素通過介導增加骨生長因子(BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1)的表達，提高去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨密度和礦物含量，改善骨組織形態(tài)學，進而加快骨折愈合。骨折修復愈合是一個極其復雜的過程，涉及多種細胞和細胞因子的相互作用，甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素在骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中起重要調(diào)節(jié)和促進作用，但其作用機制以及各細胞因子間的相互作用關系尚未完全闡明。因此，進一步明確其介導生長因子對骨細胞增殖、分化的作用和機制，尤其是各生長因子之間的相互作用是我們今后十分值得深入研究的課題。