基于生物信息學(xué)探討骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病的關(guān)系

馮蓬 陳德強(qiáng)

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性疾病。2型糖尿病的主要病理生理學(xué)特征為胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力的下降(胰島素抵抗)伴隨胰島 β細(xì)胞功能缺陷所導(dǎo)致的胰島素分泌減少(或相對(duì)減少)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病不僅僅可以導(dǎo)致全身多系統(tǒng)血管損害，也同樣會(huì)對(duì)骨代謝產(chǎn)生影響，并表現(xiàn)在骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。隨人口老齡化，人們生活方式的改變，骨質(zhì)疏松癥合并2型糖尿病的發(fā)病率居高不下，王玉楠等[2]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥高達(dá)69.6%。骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病均是嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量，給個(gè)人和國(guó)家?guī)?lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的疾病。

骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病原本是兩種相互獨(dú)立的疾病，但隨著臨床資料的積累，兩種疾病間的相互作用關(guān)系被逐漸發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的基礎(chǔ)與臨床研究投入其中。但2型糖尿病與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系始終不明確，兩種疾病同時(shí)存在骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的事實(shí)不能夠被骨密度檢測(cè)結(jié)果所解釋[3]。這需要更加深入的剖析兩者的發(fā)病機(jī)制，骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病同屬于代謝性疾病，兩者的基因易感性存在相互聯(lián)系，如含卷曲結(jié)構(gòu)域的蛋白170(CCDC170)/雌激素受體基因1(ESR1)基因在骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病中均存在密切聯(lián)系[4]，試圖從分子生物學(xué)角度構(gòu)建兩者相互關(guān)系。

隨著生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，諸多疾病數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與完善，為我們提供一條在分子水平系統(tǒng)認(rèn)識(shí)復(fù)雜疾病相互關(guān)系的途徑。骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病關(guān)系極為復(fù)雜，二者是涉及多器官、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的全身代謝性疾病，并且涉及多基因、多通路調(diào)控。因此，將多組基因數(shù)據(jù)整合分析，探討骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病的分子機(jī)制相互關(guān)系具有重要意義，并為藥物同時(shí)干預(yù)兩種疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1方法

檢索五大國(guó)際公認(rèn)的疾病數(shù)據(jù)庫(kù)以及挖掘Pubmed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)，其中包括Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)[5]、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[6]、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[7]、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)[8]、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，分別以“osteoporosis”、“type 2 Diabetes”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索與篩選。在Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)中以關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索獲得相關(guān)疾病基因；在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://db.idrblab.org/ttd/)剔除已中斷研究的藥物作用于疾病的靶點(diǎn)，僅保留藥物處于臨床試驗(yàn)或已經(jīng)成功的基因靶點(diǎn)；在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/)中僅選用以*號(hào)作為標(biāo)識(shí)的基因作為候選靶點(diǎn)；在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)，為了提高準(zhǔn)確性，僅選用經(jīng)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)且為人類(lèi)基因/蛋白的藥物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)；在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kegg.jp/)中以疾病名稱(chēng)進(jìn)行檢索，分別獲得其藥物作用于疾病的靶點(diǎn)。隨后，將獲得兩組疾病的基因/蛋白數(shù)據(jù)相互映射交集。最后，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)以確認(rèn)所獲得靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，最后將所獲得靶點(diǎn)篩選、去重。

1.2DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[10-11](https://david.ncifcrf.gov/)可用于基因富集分析及信息的可視化，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，將上述兩組疾病靶點(diǎn)分別進(jìn)行基因富集分析以及KEGG通路分析。將兩組疾病相關(guān)靶點(diǎn)相互映射并將所獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因富集分析以及KEGG通路分析。最后，利用Cytoscape[12]軟件構(gòu)建兩種疾病相互交互的通路。

2 結(jié)果

2.1以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞對(duì)五大國(guó)際公認(rèn)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲得與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的疾病基因/蛋白，其中DISGENET數(shù)據(jù)庫(kù)10個(gè)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)12個(gè)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)55個(gè)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)35、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)6個(gè)，以及通過(guò)PUBMED文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的基因/蛋白218個(gè)，共計(jì)336個(gè)?！皌ype 2 Diabetes”為檢索關(guān)鍵詞對(duì)五大常用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，以獲得與2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)，其中DISGENET數(shù)據(jù)庫(kù)33個(gè)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)38個(gè)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)198個(gè)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)45，共計(jì)314個(gè)。隨后，將兩組疾病相關(guān)基因/蛋白相互映射，獲得相交的基因/蛋白46個(gè)(表1)。最后，將所獲得靶點(diǎn)導(dǎo)入PUBMED數(shù)據(jù)庫(kù)以驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

2.2將基因/蛋白信息分別導(dǎo)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，物種僅選用“Homo sapiens”，分別分析獲得疾病基因/蛋白信息所富集的通路，并將基因信息可視化。將所獲得基因/蛋白富集通路整理成表格，利用Cytoscape構(gòu)建兩種疾病交互通路圖，獲得圖1及圖2。

表1骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病數(shù)據(jù)庫(kù)中重疊的差異基因 46個(gè)

Table1There were 46 overlapping differentially expressed genes in the osteoporosis and type 2 diabetes databases

TNFHSD11B1IL1RNFTO VEGFABTKSERPINA12SIRT1SOD2FGF21RHOANOS3LEPRATF6IL10PON1IGF1MTNR1BEIF2AK3CCL2IRS2NPYHPVDRTGFB1DPP4P2RX7IL4IL6CALCRIL17 AHLA-ALEPAPOEIGF1RPTGS2HLA-DQA1ACELMNAIL1BHLA-DQB1ALBIL1ACNR1ADIPOQSERPINE1

圖1 骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)基因富集結(jié)果Fig.1 The gene enrichment results of osteoporosis and type 2 diabetes were obtained from the DAVID database

3 討論

基于生物信息學(xué)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)，通過(guò)檢索疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，將獲得的基因通過(guò)文獻(xiàn)加以驗(yàn)證，分別將獲得的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)基因富集分析以及KEGG通路分析，使基因信息可視化。從表中可以看出，骨質(zhì)疏松癥主要涉及PI3K-AKT信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、甲狀腺素信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。在這些通路中，一些通路被廣泛研究。如NF-κB信號(hào)通路中，在ⅠκB激酶(IKK)復(fù)合體激活后，ⅠκB泛素磷酸化降解，NF-κB游離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、活性及凋亡[13]。如Wnt信號(hào)通路中，下游蛋白復(fù)合物因存在Wnt信號(hào)刺激而不發(fā)生磷酸泛素化降解而積聚在細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而啟動(dòng)靶基因如c-myc、cyclinD1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。2型糖尿病涉及的通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、胰高血糖素信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等。許多研究亦建立在這些通路中，如徐寒松等[15]認(rèn)為，黃芪多糖能夠通過(guò)激活PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路促進(jìn)2型糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增值和向內(nèi)皮細(xì)胞的分化。劉雪芹等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草多糖可增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路敏感性，改善葡萄糖代謝，從而緩解糖尿病小鼠胰島素抵抗及高血糖癥狀。

圖2 利用Cytoscape 構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病存在相互交互的通路(圖中Signaling pathway已被省略)Fig.2 Cytoscape was used to construct the interactive pathways between osteoporosis and type 2 diabetes

在骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病相關(guān)聯(lián)的通路表中，我們看到大量通路是重疊的，這表明骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病關(guān)系密切，存在著廣泛的相互作用關(guān)系，這些通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、T細(xì)胞信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、fc-εri信號(hào)通路。在PI3K/Akt通路中，王秉義等[17]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路在丹參素拮抗成骨細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，能夠上調(diào)pAkt表達(dá)，且BAX、AIF、cyto-C等與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)降低。在劉美曉等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，絲膠能夠上調(diào)PI3K以及Akt表達(dá)，改善糖尿病狀態(tài)下PI3K/Akt通路的異常，發(fā)揮降血糖作用；在NF-κB信號(hào)通路中，吳昆鵬等[19]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的和旁路的NF-κB信號(hào)通路影響細(xì)胞、破骨細(xì)胞增殖、分化，NF-κB的高表達(dá)使破骨細(xì)胞增多、骨吸收增強(qiáng)、骨形成減少。研究[20]表明，NF-κB的激活也許是導(dǎo)致β細(xì)胞功能異常的關(guān)鍵媒介，同時(shí)亦可能是糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素之一；在Jak-STAT 信號(hào)通路中，謝麗華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸在治療腎陰虛證骨質(zhì)疏松癥中差異表達(dá)基因有25條，上調(diào)11條，下調(diào)14條，其中JUN、JUNB治療后明顯上調(diào)。蘇靜等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在白芍總苷治療糖尿病大鼠過(guò)程中，腎組織Jak-STAT 信號(hào)通路中TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增高；楊亞軍等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物能夠通過(guò)FOX通路保護(hù)氧化損傷的成骨細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥；黃荷等[25]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OX是胰島素信號(hào)通路的下游關(guān)鍵分子，受上游PI3K/AKT信號(hào)磷酸化調(diào)節(jié)，與胰島β細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、衰老及代謝有著密切關(guān)系。因此，在諸多信號(hào)通路中，骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病相互影響、相互作用，有著密不可分的關(guān)系。

2型糖尿病與骨質(zhì)疏松癥的相互影響是多途徑的、綜合的，高糖環(huán)境、胰島素、糖基化產(chǎn)物、降糖藥物等都可以對(duì)骨代謝產(chǎn)生影響，是一個(gè)復(fù)雜的全身性過(guò)程[26]。研究[27]表明，高糖環(huán)境可以改變成骨細(xì)胞的生物礦化過(guò)程，可以增加RANKL、骨鈣素、BSP和Cbfa，并降低OPG表達(dá)，高葡萄糖可增加IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1和IL10mRNA的表達(dá)，增加礦物質(zhì)的數(shù)量，降低礦物質(zhì)的質(zhì)量。不同濃度的葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞作用存在差異，有研究[28]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖濃度逐漸升高時(shí)，其誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡作用更加明顯，提示高糖對(duì)成骨細(xì)胞有毒性作用。高糖環(huán)境不僅僅對(duì)成骨細(xì)胞存在影響，對(duì)破骨細(xì)胞亦存在影響，Williams等[29]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞存在葡萄糖濃度依賴(lài)性，在7～25 mmol/L的葡萄糖濃度能夠維持最大化的骨吸收活動(dòng)。因此，調(diào)控血糖與抗骨質(zhì)疏松治療是治療2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，但血糖的控制并不能因此改變糖尿病對(duì)骨代謝的影響，內(nèi)在的分子機(jī)制仍然對(duì)骨代謝產(chǎn)生重要影響。反觀目前治療2型糖尿病的藥物，有些藥物如噻唑烷二酮類(lèi)藥物、磺脲類(lèi)藥物等甚至可以增加骨量丟失與骨折風(fēng)險(xiǎn)[30-32]，這有可能會(huì)對(duì)高血糖并發(fā)癥的控制和抗骨質(zhì)疏松癥的治療帶來(lái)不利影響。在能夠同時(shí)調(diào)控2型糖尿病與骨質(zhì)疏松癥的通路中尋找共同的作用靶點(diǎn)，使得藥物能夠從基因水平調(diào)控糖代謝、骨代謝，是較為理想的治療2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的藥物。而根據(jù)基因富集結(jié)果的對(duì)比，2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的疾病機(jī)制以PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、T細(xì)胞信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、fc-εri信號(hào)通路等信號(hào)通路為主，同時(shí)針對(duì)以上這些通路的藥物亦有可能同時(shí)對(duì)骨代謝與糖代謝同時(shí)產(chǎn)生雙向調(diào)控作用，但這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病均存在龐大的疾病基因網(wǎng)絡(luò)，但這些網(wǎng)絡(luò)并不是孤立存在的，而是存在密不可分的聯(lián)系。通過(guò)相關(guān)平臺(tái)獲得的兩種疾病網(wǎng)絡(luò)相交叉的部分正是兩種疾病相關(guān)聯(lián)的部分，也是研究骨質(zhì)疏松癥與2型糖尿病相互關(guān)系的突破點(diǎn)，同時(shí)可以為藥物同時(shí)干預(yù)兩種相互關(guān)聯(lián)的疾病提供可能的靶點(diǎn)。當(dāng)然，對(duì)差異表達(dá)的基因信息進(jìn)行整合處理依賴(lài)于生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，疾病數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性、準(zhǔn)確性直接決定著整合后信息的可靠性。本研究在運(yùn)用生物信息相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)并未將基因的表達(dá)量和對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)的激活程度一并考慮在內(nèi)，這需要對(duì)生物信息學(xué)以及疾病數(shù)據(jù)庫(kù)更進(jìn)一步的完善與發(fā)展，研究結(jié)果仍需要后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與支持，使理論更加可靠。