成蚊永久性玻片標(biāo)本的制作

位廣帥,劉彬彬,王紅菊,王子鑫,張 浩,呂佳林,張 軍,徐志喜,王國英

河南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 開封475004

蚊屬于雙翅目、蚊科,是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲,對人類的直接危害是騷擾和吸血,間接危害是通過吸血傳播病原體,其中的按蚊屬、庫蚊屬、伊蚊屬與疾病關(guān)系密切,是多種蚊媒傳染病的重要傳播媒介。蚊媒傳染病是由病媒蚊子傳播的自然疫源性疾病,主要包括伊蚊傳播的登革熱、基孔肯雅熱、黃熱病、寨卡病毒病和裂谷熱等；按蚊傳播的瘧疾和淋巴絲蟲??；庫蚊傳播的流行性乙型腦炎(乙腦)、西尼羅熱和淋巴絲蟲病等。蚊媒傳染病在我國每年傳染病總發(fā)病病例中約占5%～10%,但其病死數(shù)則占傳染病總病死數(shù)30%～40%[1-2]。

控制蚊媒是控制蚊媒傳染病的重要手段,對某些蚊媒疾病來說,甚至是唯一有效手段[3]。對捕獲的蚊種進(jìn)行鑒定是控制蚊媒的重要環(huán)節(jié),對于防控蚊媒傳染病意義重大。

成蚊形態(tài)是蚊種鑒定的主要依據(jù),良好的成蚊永久性玻片標(biāo)本,既是形態(tài)研究的需要,也是實驗教學(xué)資源,并且可以長期保存。本實驗對成蚊制片過程中使用和未使用體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液的制片效果進(jìn)行了比較,對體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液消化成蚊的時間進(jìn)行了量化及對比,以期得到更好的制片效果。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗使用的成蚊為淡色庫蚊野外株。在河南省開封市金明區(qū)河南大學(xué)校區(qū)內(nèi)的苗圃、車庫、試驗田、草地、綠化帶等多個地點,通過捕蚊器采集。

1.2 采集工具

BGS-TRAP捕蚊器,由德國Biogent公司生產(chǎn),南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供。捕蚊器是一個直徑36 cm、高40 cm可折疊的藍(lán)色織物容器,黑色網(wǎng)布覆蓋在容器口上。容器中間有一個黑色的管道,可以將誘捕器附近的蚊子吸進(jìn)誘捕器內(nèi)[4]。

1.3 制片主要試劑與儀器

固定：體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇；消化：體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀；脫水：體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇；透明：無水乙醇與二甲苯(1∶1)混合液、純二甲苯。

電子天平(型號：EL303；廠家：梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；電冰箱(型號：BCD-216TMZL；廠家：青島海爾股份有限公司)；數(shù)碼顯微鏡(型號：BA210；廠家：麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)

1.4 制作方法

1.4.1 方法1

①冷凍：將收集的成蚊置于冰箱冷凍室10min后取出。②固定：成蚊置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定液中12 h,取出后置于蒸餾水中浸泡30min。③脫水、透明與封片：依次放入體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中脫水,各30 min；體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇中脫水2次,每次30 min。無水乙醇與二甲苯(比例1∶1)混合液中透明30 min；純二甲苯中透明60 s。將成蚊置于載玻片上,滴兩滴中性樹膠,加蓋玻片,平置標(biāo)本盒內(nèi),室溫陰干。

1.4.2 方法2

①冷凍：將收集的成蚊置于冰箱冷凍室10 min后取出。②固定、消化：成蚊置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定液中12 h,取出后置于蒸餾水中浸泡30 min；取出后置于體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液中消化2 h,然后,蒸餾水浸泡2次,每次30 min。③脫水、透明與封片：依次放入體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中脫水,各30 min；體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇中脫水2次,每次30 min。無水乙醇與二甲苯(比例1∶1)混合液中透明30 min；純二甲苯中透明60 s。將成蚊置于載玻片上,滴兩滴中性樹膠,加蓋玻片,平置標(biāo)本盒內(nèi),室溫陰干。

1.4.3 方法3

成蚊置于體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液中消化4 h。其他操作步驟同方法2。

1.4.4 方法4

成蚊置于體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液中消化6 h。其他操作步驟同方法2。

1.4.5 方法5

成蚊置于體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液中消化8 h。其他操作步驟同方法2。

2 結(jié)果

2.1 方法1制作的標(biāo)本

光鏡下(40×)觀察雌蚊：頭部黑色,復(fù)眼結(jié)構(gòu)不能辨認(rèn)；觸角分節(jié)、暗黃褐色,各鞭節(jié)輪毛短而??；觸須短棒狀、分節(jié)、暗黃褐色,短于喙之半；喙長針狀、暗黃褐色,末端唇瓣可見；胸部暗黃褐色；腹部分節(jié),腹末尾須可見,部分腹節(jié)內(nèi)有黑褐色條狀物；蚊翅狹長、淺黃褐色；蚊足細(xì)長、黃褐色,分節(jié)明顯(圖1A)。光鏡下(40×)觀察雄蚊：頭部黑色,復(fù)眼結(jié)構(gòu)不能辨認(rèn)；觸角分節(jié)、暗黃褐色,各鞭節(jié)輪毛長而密；觸須細(xì)長、分節(jié)、黃褐色,比喙長；喙長針狀、黃褐色,末端唇瓣可見；胸部黃褐色；腹部分節(jié),靠近胸部的腹節(jié)呈黃褐色,靠近尾部的腹節(jié)呈暗黃褐色,尾部的鉗狀抱握器可見；蚊翅狹長、淺黃褐色；蚊足細(xì)長、黃褐色,分節(jié)明顯(圖1B)。

2.2 方法2制作的標(biāo)本

光鏡下(40×)觀察雌蚊：頭部暗黃褐色,復(fù)眼部位呈較暗的淺紫色,小眼較模糊,不夠清晰；觸角分節(jié)、暗黃褐色,各鞭節(jié)輪毛短而稀；觸須短棒狀、分節(jié)、暗黃褐色,短于喙之半；喙長針狀、暗黃褐色,末端唇瓣可見；胸部呈黃褐色；腹部分節(jié)呈較亮的黃褐色,腹末尾須可見,結(jié)構(gòu)清晰；蚊翅狹長、淺黃褐色；蚊足細(xì)長、黃褐色,分節(jié)明顯(圖1C)。光鏡下(40×)觀察雄蚊：頭部暗黃褐色,復(fù)眼部位呈較暗的淺紫色,結(jié)構(gòu)模糊；觸角分節(jié)、黃褐色,各鞭節(jié)輪毛長而密；觸須細(xì)長、分節(jié)、黃褐色,比喙長；喙長針狀、黃褐色,末端唇瓣可見；胸部黃褐色；腹部分節(jié),呈黃褐色,尾部的鉗狀抱握器清晰可見；蚊翅狹長、淺黃褐色；蚊足細(xì)長、黃褐色,分節(jié)明顯(圖1D)。

圖1 方法1～5制作的成蚊標(biāo)本(40×)

2.3 方法3制作的標(biāo)本

光鏡下(40×)觀察雌蚊：頭部暗黃褐色,復(fù)眼呈較暗的淺紫色,小眼能模糊辨認(rèn)；其他觀察結(jié)果同方法2制作的雌蚊(圖1 E)。光鏡下(40×)觀察雄蚊：頭部暗黃褐色,復(fù)眼部位呈較暗的淺紫色,小眼結(jié)構(gòu)能辨認(rèn)；其他觀察結(jié)果同方法2制作的雄蚊(圖1F)。

2.4 方法4制作的標(biāo)本

光鏡下(40×)觀察雌蚊：頭部黃褐色,復(fù)眼淺紫色,小眼能辨認(rèn)；其他觀察結(jié)果同方法2制作的雌蚊(圖1G)。光鏡下(40×)觀察雄蚊：頭部黃褐色,復(fù)眼淺紫色,小眼結(jié)構(gòu)能辨認(rèn)；其他觀察結(jié)果同方法2制作的雄蚊(圖1 H)。

2.5 方法5制作的標(biāo)本

光鏡下(40×)觀察雌蚊：頭部黃褐色,復(fù)眼淺紫色,小眼能辨認(rèn)；其他觀察結(jié)果同方法2制作的雌蚊(圖1I)。光鏡下(40×)觀察雄蚊：頭部黃褐色,復(fù)眼淺紫色,小眼能辨認(rèn)；其他觀察結(jié)果同方法2制作的雄蚊(圖1J)。

2.6 不同光鏡下觀察結(jié)果比較

光鏡下(100×)觀察雌、雄蚊頭部,復(fù)眼淺紫色、由許多小眼構(gòu)成；小眼能清晰辨認(rèn)。正面觀：每一個小眼均與周圍的六個小眼相鄰,由于之間排列緊密、無縫隙,所以每個小眼呈現(xiàn)近似正六邊形形狀；復(fù)眼正面觀,結(jié)構(gòu)與蜂巢相似。側(cè)面觀：小眼排列近似魚鱗狀(圖2K：方法5制作的雌蚊頭部；圖2M：方法4制作的雄蚊頭部)。

圖2 方法4～5制作的成蚊頭部標(biāo)本(100×、400×)

光鏡下(400×)觀察雌、雄蚊頭部,復(fù)眼淺紫色、由許多小眼構(gòu)成；小眼能清晰辨認(rèn)。正面觀：每個小眼的形狀為近似小米粒的泡狀結(jié)構(gòu),相鄰小眼排列緊密、無縫隙,形成復(fù)眼的表面。小眼的一部分在表面之上,形成規(guī)則的泡狀凸起,小眼的一部分在表面之下。側(cè)面觀：凸起的泡狀結(jié)構(gòu)更明顯(圖2L：方法5制作的雌蚊頭部；圖2N：方法4制作的雄蚊頭部)。

3 討論

成蚊鑒定主要依賴形態(tài)學(xué)手段,蚊蟲的生物學(xué)和形態(tài)分類學(xué)等研究是有效控制它們的前提,完好的標(biāo)本是開展蚊蟲形態(tài)分類等研究的基礎(chǔ)[5-6]。成蚊標(biāo)本常用的制作方法有兩種,一種是針插法,一種是永久性玻片標(biāo)本制作。用針插法制成的標(biāo)本,不損壞蟲體上的鱗片或剛毛,并保持標(biāo)本原有的色澤,

且便于用解剖鏡或放大鏡進(jìn)行觀察,但易受到蟲蛀或霉變的影響,導(dǎo)致?lián)p壞而不易長期保存。永久性玻片標(biāo)本,能夠長期保存,而且在顯微鏡下可以觀察蟲體的細(xì)微結(jié)構(gòu),非常適合科研和教學(xué)使用。

本實驗采用5種方法制作成蚊永久性玻片標(biāo)本。方法2、3、4、5均使用了體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液對成蚊進(jìn)行消化,消化時間分別為：2、4、6、8 h。消化時間較短時,如消化2h時和4h制作的標(biāo)本,鏡下(40×)觀察復(fù)眼結(jié)構(gòu)不清晰。消化時間6 h或8 h時,制作的標(biāo)本鏡下(40×)觀察復(fù)眼結(jié)構(gòu)清晰。消化時間6 h或8 h時,鏡下(400×或100×)觀察,顯示復(fù)眼由許多小眼構(gòu)成,數(shù)量不定；正面觀每個小眼呈現(xiàn)近似正六邊形形狀,與周圍的六個小眼相鄰,排列緊密、無縫隙,結(jié)構(gòu)與蜂巢相似；側(cè)面觀小眼呈規(guī)則的泡狀凸起,排列近似魚鱗狀。

體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀對蚊體的處理,能夠使蚊體內(nèi)部軟組織溶解并使幾丁質(zhì)色素減退[7]。消化時間不同,制作標(biāo)本的觀察效果有較大差異,主要在蚊頭部結(jié)構(gòu)的清晰度及復(fù)眼結(jié)構(gòu)能否辨認(rèn)、結(jié)構(gòu)是否清晰,而對其他結(jié)構(gòu)的觀察,影響較小。

方法1沒有使用體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液對成蚊進(jìn)行消化,制作的標(biāo)本鏡下(40×)觀察,蚊頭部呈黑色,復(fù)眼結(jié)構(gòu)不能辨認(rèn),腹節(jié)內(nèi)的內(nèi)容物也存在,說明在制作過程中若不對成蚊進(jìn)行消化處理,直接影響玻片標(biāo)本的觀察,特別是蚊頭部復(fù)眼,完全不能觀察；其他結(jié)構(gòu)鏡下可以觀察,但效果不佳。

關(guān)于成蚊永久性玻片標(biāo)本的制作,文獻(xiàn)報道[7]需用體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液浸泡,浸泡時間需要視標(biāo)本的情況而定。消化時間不固定,不同的制作者認(rèn)定的消化效果沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)個人的經(jīng)驗和觀察而定,制作的標(biāo)本觀察效果可能有較大差別。

在成蚊標(biāo)本制作過程中,每一步驟都關(guān)系標(biāo)本的觀察效果,消化步驟尤其重要。本實驗量化了體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液對成蚊的消化時間,使制作過程更易操作。實驗結(jié)果顯示,使用體積分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鉀溶液對成蚊消化6 h或8h,制作的標(biāo)本鏡下觀察結(jié)構(gòu)清晰,適用于科研、教學(xué)。