捕撈應(yīng)激對(duì)團(tuán)頭魴不同組織中Nrf2-Keap1信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

趙振新， 楊明舉， 張顯波， 趙 鳳， 楊 星， 趙 飛， 劉 偉

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

魚(yú)類(lèi)的應(yīng)激反應(yīng)(Stress response)是指魚(yú)類(lèi)對(duì)超過(guò)其正常生活范圍的異常因素刺激所產(chǎn)生的一種非特異性生理反應(yīng)，包括初級(jí)應(yīng)激反應(yīng)(血液中皮質(zhì)類(lèi)膽固醇和茶酚胺類(lèi)物質(zhì)濃度升高)和次級(jí)應(yīng)激反應(yīng)(代謝與機(jī)能的改變，如器官組織應(yīng)激損傷，肝組織糖原含量變化等)[1]。應(yīng)激反應(yīng)對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康具有雙重作用，過(guò)度或過(guò)長(zhǎng)的應(yīng)激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激可增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)能力，不同的應(yīng)激反應(yīng)在生產(chǎn)中被分別予以預(yù)防和利用[2]。在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖、捕撈、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中會(huì)對(duì)魚(yú)體產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激作用，嚴(yán)重時(shí)可引起魚(yú)類(lèi)行為異常、皮膚滲透性增強(qiáng)、食欲下降、生殖力降低、生長(zhǎng)受到抑制、抵抗力下降甚至死亡等[3]。如黃顙魚(yú)運(yùn)輸過(guò)程中，第0～3天的皮質(zhì)醇含量明顯高于第7～35天，在第7天時(shí)血清皮質(zhì)醇含量明顯減少[4]。陳鵬飛等[5]研究擁擠脅迫對(duì)苗王云鯽的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，脅迫第3天魚(yú)體內(nèi)的皮質(zhì)醇和血糖含量均達(dá)最大值，此后含量緩慢下降，30 d后維持正常水平。因此，研究魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)特點(diǎn)可有效降低水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程各種應(yīng)激源對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)健康和存活率的影響有重要的指導(dǎo)作用。

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)俗稱(chēng)武昌魚(yú)，隸屬硬骨魚(yú)綱，鯉形目，鯉科，鮊亞科，魴屬。團(tuán)頭魴是我國(guó)大宗淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，具有養(yǎng)殖成本低、生長(zhǎng)快、規(guī)格適中、含肉率高等優(yōu)點(diǎn)，被作為優(yōu)良的淡水養(yǎng)殖品種在全國(guó)推廣[6-7]。由于團(tuán)頭魴對(duì)環(huán)境的應(yīng)激比較敏感[8]，生產(chǎn)中捕撈、養(yǎng)殖密度改變等產(chǎn)生的應(yīng)激均會(huì)嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育和存活率。目前關(guān)于團(tuán)頭魴應(yīng)激反應(yīng)的研究已有諸多報(bào)道，如密度、藥物應(yīng)激[9-10]等，但關(guān)于捕撈應(yīng)激相關(guān)研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者等研究捕撈應(yīng)激對(duì)團(tuán)頭魴體內(nèi)不同組織器官產(chǎn)生氧化應(yīng)激過(guò)程中Nrf2-Keap1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況，以期從機(jī)理上了解捕撈對(duì)團(tuán)頭魴產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的變化情況，從而為其水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及免疫防控技術(shù)的研究提供理論支撐。

1材料與方法

1.1材料

團(tuán)頭魴由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉漁場(chǎng)提供，150 g左右，體質(zhì)健康無(wú)傷。飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，飼料為通威股份無(wú)錫分公司顆粒飼料(粗蛋白:32%)。試驗(yàn)中所需的團(tuán)頭魴基因全長(zhǎng)序列NOX2、Nrf2、Keap1、Bach1、CAT和SOD從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心水產(chǎn)病害與飼料研究室的團(tuán)頭魴基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中所得。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)。挑選12尾體量為(150±0.35)g健康充滿活力的團(tuán)頭魴，在室內(nèi)循環(huán)水槽中飼養(yǎng)3周，每天投喂3次(8:20-9:00、11:30-12:10和16:50-17:30)，飽食。飼養(yǎng)期間循環(huán)水系統(tǒng)日夜連續(xù)循環(huán)并充氣增氧，飼養(yǎng)溫度(26±1)℃，pH 7.2～7.8，DO>6 mg/L，H2S<0.01 mg/L，光照周期為光照∶黑暗=14 h∶10 h。保持室內(nèi)安靜以避免對(duì)魚(yú)產(chǎn)生驚擾應(yīng)激。

采樣前將魚(yú)停食24 h，并將水槽內(nèi)水深降至10 cm，迅速用抄網(wǎng)將魚(yú)全部撈出，并在空氣中暴露5 min后放入事先備好的MS-222(濃度為100 mg/L)中做快速深度麻醉，取魚(yú)鰾(S-B)、肝臟(L)、腎臟(K)、腸道(I)、心臟(H)、肌肉(M)、腦(B)、脾臟(S)及頭腎(H-K)等組織用液氮速凍后于-80℃保存，用于分子生物學(xué)測(cè)定。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

引物根據(jù)團(tuán)頭魴Nrf2、Keap1和Bach1基因序列及內(nèi)參基因β-actin (GeneBank Accession No. AY170122.2)設(shè)計(jì)[11](表1)。

表1 團(tuán)頭魴Nrf2、Keap1和Bach1基因熒光定量PCR引物

1.4cDNA的提取

根據(jù)楊震飛等的方法[9]，按照TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取腸道、肝臟、魚(yú)鰾等組織的總RNA，并通過(guò)電泳檢測(cè)RNA的完整性，一般OD260/280為1.8～2.0。并以DNAase I處理過(guò)的RNA及RT液為模板，確定處理過(guò)的樣品RNA中無(wú)DNA污染。最后，采用TaKaRa Prime Script?RT reageat Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并置于—20℃保存待用。

1.5SYBR Green I Real Time PCR反應(yīng)

各組織中Nrf2、Keap1和Bach1相對(duì)表達(dá)水平的確定采用崔素麗[12]的方法。在熒光定量擴(kuò)增效率一致的前提下，使用β-actin對(duì)測(cè)定的Ct值做均一化處理，以對(duì)照組中mRNA為基準(zhǔn)，用2-ΔΔCt法獲得基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用Duncan對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，在單因素方差分析基礎(chǔ)上利用SPSS 20.0檢驗(yàn)各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)的差異性。

2結(jié)果與分析

2.1捕撈應(yīng)激團(tuán)頭魴不同組織中3種基因的表達(dá)量

Nrf2-Keap1信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果(圖1)顯示，當(dāng)團(tuán)頭魴受到捕撈應(yīng)激后，腸道和肝臟中的氧化應(yīng)激表現(xiàn)最激烈，Nrf2、Keap1和Bach1基因均出現(xiàn)極顯著的表達(dá)上調(diào)。但魚(yú)鰾、腎臟、心臟、肌肉、腦、脾臟及頭腎中的基因表達(dá)量無(wú)顯著變化，表明，捕撈應(yīng)激反應(yīng)主要集中在肝臟和腸道中。

注：不同小寫(xiě)字母表示不同組織間基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate significance of difference in gene expression among different tissues atP<0.05 level.

圖1 捕撈應(yīng)激團(tuán)頭魴不同組織中Nrf2 、Keap1和Bach1 基因的表達(dá)量

Fig.1 Expression ofNrf2,Keap1 andBach1 gene in different tissues ofM.amblycephalaunder rapid fishing stress

2.2捕撈應(yīng)激團(tuán)頭魴肝臟和腸道Nrf2-Keap1信號(hào)通路

從圖2看出，在魚(yú)體受到捕撈應(yīng)激時(shí)，肝臟和腸道中的組織細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而激活呼吸爆發(fā)相關(guān)活性酶產(chǎn)生ROS，過(guò)多的ROS激活Nrf2和Keap1，促使Nrf2與Keap1分離進(jìn)入細(xì)胞核，然后與細(xì)胞核中的Bach1相互作用產(chǎn)生細(xì)胞因子激活SOD、CAT等抗氧化酶，而抗氧化酶會(huì)消除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，以減少捕撈應(yīng)激所帶來(lái)的損傷。

圖2 捕撈應(yīng)激團(tuán)頭魴肝臟和腸道細(xì)胞中Nrf2-Keap1的信號(hào)通路

Fig.2 Signal channel of Nrf2-Keap1 in liver and intestinal cell ofM.amblycephalaunder rapid fishing stress

3結(jié)論與討論

應(yīng)激是一種反應(yīng)模式，是指動(dòng)物機(jī)體受到外界或內(nèi)部不良因素刺激后，所產(chǎn)生的一系列非特異性應(yīng)答反應(yīng)[13-14]。但同一種刺激對(duì)機(jī)體不同組織所造成的應(yīng)激反應(yīng)有所不同。商振達(dá)等[15]研究得出，饑餓應(yīng)激對(duì)不同部位肌肉的糖酵解指標(biāo)和品質(zhì)指標(biāo)有不同程度的影響，其中饑餓應(yīng)激對(duì)股二頭肌的糖酵解指標(biāo)和品質(zhì)指標(biāo)影響最大。YANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖團(tuán)頭魴，其產(chǎn)生的應(yīng)激可導(dǎo)致腸道產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，但對(duì)肌肉和腦卻不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的傷害。研究表明，捕撈所產(chǎn)生的應(yīng)激對(duì)腸道和肝臟產(chǎn)生較明顯的影響，顯著促進(jìn)組織細(xì)胞中呼吸爆發(fā)活性，從而激活抗氧化信號(hào)通路Nrf2-Keap1中相關(guān)基因的活性，但對(duì)于腦、腎臟、肌肉等組織卻無(wú)顯著影響。表明，捕撈所產(chǎn)生的瞬時(shí)應(yīng)激反應(yīng)主要集中在肝臟和腸道中。

應(yīng)激可直接或間接促進(jìn)生物體內(nèi)ROS生成，而ROS可與組織的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)及核酸分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，發(fā)揮殺菌作用，參與宿主細(xì)胞的免疫。在此過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)中的 NADPH 氧化酶(NOX)會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，與膜上的NADPH結(jié)合產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，最后轉(zhuǎn)換成ROS[17-18]。然而，過(guò)量的ROS會(huì)引發(fā)細(xì)胞的氧化損傷，阻礙生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育[19]。研究表明，捕撈所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)顯著促進(jìn)了肝臟和腸道細(xì)胞中Nrf2、Keap1和Bach1基因的表達(dá)，說(shuō)明短暫的瞬時(shí)應(yīng)激已經(jīng)激活了肝臟和腸道內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使抗氧化系統(tǒng)開(kāi)始發(fā)生反應(yīng)，抵抗應(yīng)激所帶來(lái)的傷害。徐蕾[20]研究也得出，短期饑餓應(yīng)激便可導(dǎo)致翹嘴鱖腸道發(fā)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量也顯著增加。鄧悅[21]研究發(fā)現(xiàn)短暫的氧化應(yīng)激可引起大鼠內(nèi)耳發(fā)生氧化損傷，從而導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)器官損傷。

短暫的捕撈應(yīng)激中，腦、肌肉、腎臟等組織中的Nrf2、Keap1和Bach1 m RNA 表達(dá)量沒(méi)有出現(xiàn)上調(diào)，在食蚊魚(yú)的研究中應(yīng)激初期也有類(lèi)似的結(jié)果[22]。在大黃魚(yú)鋅的急性氧化應(yīng)激初期試驗(yàn)中，Nrf2-Keap1相關(guān)基因的表達(dá)量同樣沒(méi)有顯著上調(diào)[23]。說(shuō)明，捕撈所產(chǎn)生的應(yīng)激強(qiáng)度較小且短暫，未對(duì)團(tuán)頭魴機(jī)體整體抗氧化防御系統(tǒng)造成大的影響，機(jī)體處于可調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡中。但如果持續(xù)的、高強(qiáng)度的捕撈應(yīng)激，可能會(huì)影響抗氧化應(yīng)激能力，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，相關(guān)研究還有待進(jìn)行。