H9和H6亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測方法的建立

李 丹， 李 孟， 謝芝勛， 羅思思， 謝麗基， 張民秀，黃嬌玲, 范 晴, 王 盛, 謝志勤， 鄧顯文， 曾婷婷， 張艷芳

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室， 廣西 南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是正黏病毒科中A型流感病毒屬成員。根據(jù)其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)的差異可將AIV劃分為16種不同的HA亞型(H1～H16)和9種不同的NA亞型(N1～N9)[1-3]。依據(jù)AIV對雞致病性的強弱，AIV還可分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。H9亞型AIV自1966年在美國首次被發(fā)現(xiàn)以來，目前已經(jīng)給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了十分嚴重的經(jīng)濟損失[4]。自1998年廣東首次發(fā)現(xiàn)人感染H9N2亞型AIV病例以來，H9N2亞型AIV感染人事件也在不斷的發(fā)生[5]。H6亞型AIV屬于LPAIV，在中國、北美和歐洲等地區(qū)已被廣泛發(fā)現(xiàn)[6-7]。研究表明，H6亞型AIV感染范圍廣泛，其天然宿主主要為水禽，其他陸生禽類感染率相對較少[8]。我國自2000年以來已不斷有H6亞型AIV分離的報道，而且還在人群中檢測到H6亞型AIV的特異性抗體[9-10]，更為嚴重的是臺灣地區(qū)已經(jīng)于2013年6月發(fā)現(xiàn)1例H6N1直接感染人的病例[11]。近年來的低致病性禽流感的流行病學監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，H9和H6亞型禽流感病毒混合感染普遍存在，部分H9N2和H6N6亞型AIV可為H5N6和H7N9等亞型高致病性禽流感病毒提供內(nèi)部基因[12-13]。因此，開展H9與H6亞型AIV的研究對家禽養(yǎng)殖及人類健康衛(wèi)生具有重要意義。

由于傳統(tǒng)的禽流感病毒檢測方法存在病毒分離培養(yǎng)周期長且需要血清學方法鑒定，而血清學方法要用較多標準陽性血清，但是禽流感病毒不同亞型血清相互間存在不同程度的交叉免疫保護反應，其結果的準確性具有局限性，所以目前禽流感病毒較多采用分子生物學方法進行檢測。分子生物學方法特別是RT-PCR檢測技術具有快速、簡便和準確等優(yōu)點，在禽流感的診斷及大規(guī)模監(jiān)測過程中應用廣泛[14]。由于AIV感染動物后具有相似的臨床癥狀，混合感染的現(xiàn)象也普遍存在，所以在日常診斷中難以及時、準確地對其進行鑒別確診。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，多重PCR技術的應用也越來越廣泛，特別是在禽流感診斷領域中，但關于三重RT-PCR檢測區(qū)分H9與H6亞型AIV混合感染的方法鮮見報道。鑒于此，依據(jù)Genbank中H9和H6亞型AIV的HA基因及所有亞型AIVM基因的保守序列，分別設計3對特異性引物，優(yōu)化退火溫度和引物濃度及其配比等條件，建立優(yōu)化可同時檢測H9與H6亞型AIV的三重RT-PCR檢測方法，并對所建方法進行特異性、敏感性及臨床樣品檢測的驗證，旨在為H9與H6亞型AIV的監(jiān)測及其防控提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株AIV毒株(H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV及ILTV)均由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存；AIV(H7N2、H14N5、H15N9和H16N3)的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈；AIV毒株(H5N1)cDNA 模板由美國康涅狄格州立大學惠贈；其他AIV毒株(H2N3、H4N5、H8N4、H6N8、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5)或cDNA 模板均由香港大學惠贈。

1.1.2試劑SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，DL 1 000 bp DNA Marker、感受態(tài)細胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體、膠回收試劑盒及小量質粒抽提試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。MLV逆轉錄酶、隨機引物、10 mmol dNTP、RNA抽提試劑盒、2×PCR Mix及RNA抑制劑均購自寶生物(北京)有限公司。其他試劑均購自商業(yè)公司。

1.2方法

1.2.1引物的設計及合成從GenBank中下載各種不同亞型禽流感病毒的M基因序列、H9和H6亞型AIV的HA基因序列，運用DNAStar比對分析上述序列，找出特異性的保守區(qū)域，然后運用Primer Premier 5.0結合Oligo 7設計并通過驗證篩選出3對針對M基因、H9和H6亞型AIVHA基因進行擴增的特異性引物。引物由寶生物(大連)有限公司合成。引物序列及目的片段大小見表1。

表1 禽流感病毒H9和H6亞型HA和M基因引物序列

Table 1 Prime Sequence forHAandMgene in H9 and H6 subtype AIV

引物Primer引物序列(5′→3′)Prime Sequence擴增產(chǎn)物/bp Amplification productM-F AAACGCCCTAAATGGGAATGGA 667M-R TCCCTCATAGACTCAGGCATT H6-F GTGCACCATCCTCCTGTCAC 478H6-R TGAAGCCTGCAATAGCTCCAA H9-F ACTCGATGAGCATGATGCAAA 299H9-R AGAAGGCAGCAAACCCCATT

1.2.2病原RNA/DNA的提取與cDNA合成參照核酸抽提試劑盒使用說明抽提AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV的DNA，抽提后的核酸模板用33 μL RNA-free水溶解。RNA模板參照寶生物反轉錄試劑盒的說明合成cDNA，所有核酸模板均于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3三重RT-PCR反應體系的建立及優(yōu)化運用25 μL反應體系：2×PCR Mix 12.5 μL，H9與H6亞型AIV cDNA模板各1 μL，引物M-F、M-R、H9-F、H9-R、H6-F和H6-R (20 pmol/μL)分別加入0.1～1.0 μL，共10個梯度，每個梯度遞增0.1 μL，優(yōu)化2個引物組合的濃度，用RNA-free補足至25 μL。同時根據(jù)濃度試驗的效果再對退火溫度及反應時間進行組合優(yōu)化，最終確定最佳反應體系及條件。

1.2.4特異性試驗運用上述所建立的三重RT-PCR檢測方法按照對H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N8、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N5、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV和ILTV的cDNA/DNA進行檢測，驗證所建方法的特異性。

1.2.5標準品的制備分別以H9N2與H6N6毒株cDNA為模板擴增M基因和HA基因，得到其全長目的片段，并將目的片段分別連接到載體上并送測序。將插入有H9與H6亞型AIV的HA基因和M基因全長片段并測序正確的重組質粒分別命名為M-T、H9-T和H6-T。用商品化的質粒抽提試劑盒分別提取含有M-T、H9-T和H6-T的質粒，并用微量核酸檢測儀測定其濃度，根據(jù)相關公式計算樣品相對應的拷貝數(shù)，同時將M-T、H9-T與H6-T質粒等拷貝數(shù)混合，并按10倍的倍比稀釋混合樣品，以便獲得M-T、H9-T與H6-T質粒DNA濃度均為5×102～5×107拷貝/μL的標準品。

1.2.6敏感性試驗運用上述優(yōu)化好的三重RT-PCR檢測方法對制備好的濃度為5×10～5×109拷貝/μL的M-T、H9-T與H6-T質粒樣品進行擴增，驗證該檢測方法的敏感性。

1.2.7臨床樣品檢測運用所建立的三重PCR檢測方法對近期從南寧、柳州和防城港不同活禽市場采集的152份雞和鴨咽喉及泄殖腔棉拭子樣品的部分進行PCR檢測鑒定，同時將相同編號剩余樣品經(jīng)過處理后接種SPF雞胚進行流感病毒的分離與血清學鑒定，將鑒定H9與H6亞型AIV為陽性的樣品進行HA基因的序列測定，所有M基因陽性樣品也進行序列測定。然后將上述方法的檢測結果進行對比，進而驗證三重RT-PCR檢測結果的準確性。

2結果與分析

2.1H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR反應條件

對M基因、H9與H6亞型AIVHA基因3對特異性引物濃度比例及擴增溫度時間等的優(yōu)化得到三重RT-PCR反應的最佳體系：2×PCR Mix 12.5 μL，H9與H6亞型AIV cDNA共2 μL為模板，特異性引物M-F和M-R(20 pmol/μL)加入量為0.6 μL、特異性引物H9-F和H9-R(20 pmol/μL)的加入量為0.7 μL，特異性引物H6-F及H6-R(20 pmol/μL)的加入量為1 μL，用RNA-free水補足至終體積為25 μL。對退火溫度進行梯度優(yōu)化篩選確定該反應體系的最佳退火溫度為53℃。

2.2H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR反應條件的驗證情況

2.2.1特異性從圖1看出，用建立的三重RT-PCR法從H9及H6亞型AIV混合樣品分別檢測出3條特異性條帶，分別為667 bp(通用)、478 bp(H6亞型)及299 bp(H9亞型)；對H9N2和H9N6亞型AIV PCR檢測的結果僅出現(xiàn)2條特異性條帶，片段大小分別為667 bp和299 bp；對H6N2亞型AIV進行擴增僅檢測出2條特異性條帶，片段大小分別為667 bp和478 bp；對其他亞型AIV僅有1條667 bp的特異性條帶，常見的禽病病原體均未擴增出條帶。表明，所建立的三重RT-PCR法具有良好的特異性。

2.2.2敏感性從圖2看出，對濃度為5×102～5×107拷貝/μL的M基因、H6與H9亞型的AIV均有3條明顯的特異性擴增條帶，片段大小分別為667 bp、478 bp和299 bp；對濃度小于5×103拷貝/μL的M基因、H6與H9亞型AIV均無擴增條帶。由此可見，該法最低能同時檢測到質粒模板量為5×103拷貝/μL的M基因、H6與H9亞型AIV。

注：M．DL1000 DNA Marker；1.H9N2+H6；2.H9N6+H6；3.H6N6；4.H6N2；5.H6N8；6.H9N2；7.H9N6；8.H1N2；9.H2N2；10.H3N2；11.H5N1；12.H7N2；13.H10N3；14.H11N3；15.H12N5；16.H14N5；17.H15N9；18.H16N3；19.H4N5；20.IBV；21.ILTV；22.NDV；23.陰性對照。

Note:M．DL1000 DNA Marker；1.H9N2+H6；2.H9N6+H6；3.H6N6；4.H6N2；5.H6N8；6.H9N2；7.H9N6；8.H1N2；9.H2N2；10.H3N2；11.H5N1；12.H7N2；13.H10N3；14.H11N3；15.H12N5；16.H14N5；17.H15N9；18.H16N3；19.H4N5；20.IBV；21.ILTV；22.NDV；23.negative control.

圖1 H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR特異性

Fig.1 Specificity of H9 and H6 subtype AIV by triplex RT-PCR

注：M為DNA標準DL1000；1～6分別為濃度1.5×107拷貝/μL、2.5×106拷貝/μL、3.5×105拷貝/μL、4.5×104拷貝/μL、5.5×103拷貝/μL和6.5×102拷貝/μL；7.陰性對照。

Note: M, DNA Marker DL1000; the concentration from 1 to 6 is 1.5×107copies/μL, 2.5×106copies/μL, 3.5×105copies/μL, 4.5×104copies/μL, 5.5×103copies/μL and 6.5×102copies/μL, respectively; 7. negative control.

圖2 H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR敏感性

Fig.2 Sensitivity of H9 and H6 subtype AIV by triplex RT-PCR

2.2.3臨床樣品檢測樣品PCR檢測的結果顯示，有13份樣品為H9與H6亞型AIV混合感染陽性，陽性率為8.55%；28份樣品能擴增出299 bp的目的條帶，為H9Nx AIV，陽性率為18.42%；6份樣品能擴增出478 bp的目的條帶，為H6Nx AIV，陽性率為3.95%；有18份僅有667 bp的目的條帶，是除H6Nx和H9Nx外的其他亞型禽流感病毒。部分活禽市場棉拭子樣品PCR檢測結果見圖3。上述樣品檢測結果與經(jīng)典的雞胚病毒分離鑒定，及其HA基因和M基因測序結果100%相符。

注：M.DNA標準DL1000；5和7為H6亞型AIV陽性產(chǎn)物；1、9、12和17為H9亞型AIV陽性產(chǎn)物；3和19為H9與H6亞型AIV的陽性產(chǎn)物；8、13和15為其他亞型AIV的陽性產(chǎn)物；其余為陰性產(chǎn)物。

Note: M, DNA Marker DL1000; 5 and 7, positive products of H6 subtype AIV; 1, 9, 12 and 17, positive products of H9 subtype AIV; 3 and 19, positive products of H6 and H9 subtype AIV; 8 ,13 and 15, positive products of other subtype of AIV; the others are negative products.

圖3 部分活禽棉拭子樣品的RT-PCR檢測

Fig.3 Detection of cotton swab samples from some live poultry by RT-PCR

3結論與討論

自20世紀90年代H9亞型AIV在中國被發(fā)現(xiàn)以來，已在全國各養(yǎng)殖區(qū)流行，該亞型病毒的流行不僅給中國的家禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，且可直接感染人(H9N2亞型AIV)，給人類帶來致病風險，直至目前，其直接感染人病例還在不斷出現(xiàn)。H6亞型AIV對家禽呈現(xiàn)低致病性，但是其可跨越種屬屏障直接感染人，可在健康人群血清中檢測到H6亞型AIV抗體陽性，甚至在2013年6月中國臺灣出現(xiàn)首例人感染H6N1亞型AIV的病例[15]。近年的研究表明，H9和H6亞型LPAIV還可為H7N9和H5N6等HPAIV的重組提供內(nèi)部基因[16-17]，這些“新毒株”已對人類公共衛(wèi)生的安全構成了嚴重威脅，已引發(fā)全球科學家對H9與H6亞型AIV的密切關注和深入研究。

近年來，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所持續(xù)多年對廣西地區(qū)家禽中LPAIV流行情況的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，廣西家禽中LPAIV感染比例較高的是H9亞型AIV，H6亞型AIV也經(jīng)常在鴨和鵝中被檢測到，該結果與華東地區(qū)等中國其他地區(qū)LPAIV的監(jiān)測結果[18-20]基本一致。由于LPAIV在家禽體內(nèi)多以混合感染形式存在，且多數(shù)病毒對家禽的致病性不強，臨床癥狀及剖檢病變極其相似，肉眼和常規(guī)方法難以快速準確地鑒別診斷。目前，對于H9與H6亞型AIV的混合感染主要采用傳統(tǒng)的病毒分離及血清學方法進行鑒定，該方法不僅耗時且準確性難保證，迫切需要建立一種快速有效地檢測及鑒別H9與H6亞型AIV的方法，為2種亞型AIV的快速準確鑒別提供可靠的技術支撐。

通過軟件設計針對H9與H6亞型AIVHA基因及M基因的特異性引物，經(jīng)過對不同引物組合進行試驗篩選得到擴增效果較好的1個引物組合，然后對反應體系中引物濃度、引物比例、退火溫度和擴增時間進行優(yōu)化，最終建立可同時檢測H9與H6亞型AIV的方法。該方法只能特異性擴增出H9與H6亞型AIVHA基因及M基因，不能檢測出其他亞型AIVHA基因及其他常見家禽病原的核酸。敏感性試驗結果表明，該方法最低能檢測到量為5×103拷貝/μL的3種質粒的模板。另外，不同地區(qū)采集的152份臨床樣品的檢測結果也表明，其與病毒分離及測序結果完全相符。綜上，研究已成功建立了一種能夠同時檢測H9與H6亞型AIV三重RT-PCR方法，一次PCR反應便可同時確定樣品中H9與H6亞型AIV的混合感染及單一感染情況，該方法具有特異性強、快速簡便及易操作等優(yōu)點，十分適于在基層單位應用推廣，有利于畜牧業(yè)的健康發(fā)展，可為H9與H6亞型AIV的監(jiān)測及其防控提供技術支撐。