不同作物間作對烤煙根際土壤細菌群落組成及功能的影響

張開虹， 桑維鈞， 何世芳， 袁清婷， 徐敏菊

(貴州大學(xué) 煙草學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

植物根系與土壤發(fā)生相互作用緊密的微域環(huán)境，稱之為根際環(huán)境(Rhizosphere)，包括碳水化合物、氨基酸以及生長物質(zhì)等諸多成分，是植物在生長、吸收及分泌過程中形成的物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)不同于土體的復(fù)雜動態(tài)微型生態(tài)系統(tǒng)。土壤微生物作為土壤環(huán)境的重要組成部分，會形成各種有機酸、激素、抗生素、醇和維生素等多種產(chǎn)物，從而影響土壤養(yǎng)分的供應(yīng)狀況，改變植物根際土壤營養(yǎng)和氧化還原條件等，在土壤養(yǎng)分和有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化與增加過程中發(fā)揮著重要作用，進而對植物的生長發(fā)育及產(chǎn)質(zhì)量產(chǎn)生影響[1]。土壤微生物的種類、數(shù)目及活性可宏觀且真實地反映土壤的營養(yǎng)狀況[2]。土壤微生物區(qū)系失衡和多樣性是土壤傳播植物病害的潛在原因[3]。優(yōu)良健康的根際環(huán)境是農(nóng)作物生長的重要基礎(chǔ)，了解根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的多樣性及其影響因素對農(nóng)作物生長及污染土地修復(fù)等都具有重要意義。

利用植物與微生物互作提高資源利用，減少農(nóng)藥和化肥的投入是農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的重要內(nèi)容之一。大量研究表明，間套作和輪作模式中作物通過直接或間接作用改變土壤環(huán)境，能夠使植物充分利用水分和養(yǎng)分、抑制雜草滋生和控制病蟲害等[4-8]。但目前有關(guān)烤煙種植土壤微的生物區(qū)系，尤其是間套作條件下的烤煙根際土壤微生物環(huán)境的研究較少。一直以來，在實際生產(chǎn)上烤煙套作甘薯的種植方法已很普遍[9]。有研究表明，烤煙套作甘薯不僅可一定程度上改善煙葉的內(nèi)在品質(zhì)，顯著提高烤煙煙葉總糖含量、還原糖含量和糖堿比，降低氯含量[10]，還能在病蟲害防治方面減輕烤煙病毒病、角斑病和野火病的危害[11-12]。而間作甘薯是否也能夠具有相似效果還缺乏研究。丹參是一種唇形科藥用植物，在全國大部分地區(qū)都有分布，是世界公認的治療心腦血管病的首選藥物之一[13]，與大多數(shù)作物一樣在栽培過程中存在連作障礙，但其與烤煙間作效果如何未見研究報道。利用豆科作物與根瘤菌共生產(chǎn)生的固氮作用，豆科與非豆科作物間套作也是傳統(tǒng)間套作的重要種植模式之一。蠶豆與玉米間作能夠提高玉米對養(yǎng)分的吸收量及其產(chǎn)量[14-16]，鮮見該模式在烤煙上的研究報道。為此，以單作烤煙為對照，選擇甘薯〔Ipomoeabatatas(L.) Lam.〕、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)和大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕3種不同類型作物，研究3種不同作物與烤煙間作對根際土壤細菌群落組成及功能的影響，以期為連作障礙的生態(tài)調(diào)控提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗于2018年4-8月在貴州省遵義市綏陽縣蒲場煙草科技示范園(107°08′E,27°89′N)進行，該地屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均降雨量在900～1 250 mm，無霜期280 d左右。

1.2材料

1.2.1烤煙品種云煙87，當(dāng)?shù)厣a(chǎn)上的主栽品種。

1.2.2土壤樣品共計48份，采自烤煙-甘薯、烤煙-丹參(B)、烤煙-大豆和單作烤煙(CK)4個處理的烤煙根際的土壤，每個處理12份。

1.3方法

1.3.1試驗設(shè)計間作共設(shè)4個處理：單作烤煙為對照(CK)；A，烤煙-甘薯；B，烤煙-丹參；C，烤煙-大豆。3次重復(fù)，共12個小區(qū)，均勻輪替分布?？緹熼g距50 cm，烤煙移栽后10 d間作甘薯、丹參和大豆。甘薯與丹參采用移栽種植，大豆在3 cm土層穴播，每穴播種3～4粒，間作作物與煙株均間隔15 cm左右(圖1)。試驗期間除草灌溉、病蟲害防治等管理措施按常規(guī)方法進行。

Fig.1 Schematic layout of tobacco intercropped withI.batatas,S.miltiorrhizaandG.max

1.3.2樣品采集烤煙于移栽后的第10天與甘薯、丹參和大豆間作，分別于還苗期(T1)、伸根期(T2)、旺長期(T3)和成熟期(T4)采集4個間作處理的烤煙根際土壤。T1為間作當(dāng)天第1次采集土樣的時期(還苗期),以后每隔25 d采樣1次，即T2、T3和T4對應(yīng)烤煙的生育期分別為伸根期、旺長期和成熟期。

每個小區(qū)隨機選取4株烤煙連根拔起，抖掉周圍土壤，將每個重復(fù)的根際土壤用毛刷分別刷入滅菌袋內(nèi)，將相同小區(qū)土樣混合。將采得土樣放置干冰盒中，帶回實驗室于-80℃保存，用于后續(xù)DNA提取。

1.3.3土壤DNA提取與測序采用CTAB法提取樣本的基因組DNA，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模版，采用16S rRNA基因中的V3～V4區(qū)引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行擴增。PCR擴增條件：98℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，然后再在72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后再次進行瓊脂糖凝膠電泳確認，再用GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific)剪切回收目標條帶。高通量測序基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)的IonS5TMXL測序平臺，測序深度為每個文庫原始讀數(shù)(reads)不少于4萬條，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.4數(shù)據(jù)處理與分析

1) 樣品有效序列的獲取。初始數(shù)據(jù)按照Barcode序列和PCR擴增引物序列拆分出各樣品數(shù)據(jù)，將Barcode序列和引物序列截去后，經(jīng)FLASH對每個樣品的讀數(shù)進行拼接，獲得原始數(shù)據(jù)(Raw Data)，然后參照QIIME對原始數(shù)據(jù)進行拼接過濾后得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。

2) 樣品有效序列的可分類單元(OTUs)聚類。使用UPARSE將有效數(shù)據(jù)以97%相似性(Identity)為依據(jù)進行可分類單元(OTUs)聚類，每個OUT代表1個物種。

3) 細菌的群落多樣性。采用R軟件繪制稀釋曲線反映土壤樣品中的細菌信息，依據(jù)聚類結(jié)果再用QIIME進行Alpha多樣性計算分析和對每個OTU的代表序列進行物種注釋，得到相應(yīng)的物種信息和相對豐度分布情況。采用群落豐富度Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)以及群落多樣性香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)進行評估，以平均覆蓋度(Goods coverage)反映測序深度。

4) 細菌代謝功能的預(yù)測。Tax4Fun是基于16S Silva數(shù)據(jù)庫的用于腸道、土壤等環(huán)節(jié)樣品功能預(yù)測的R程序包，利用其對基于細菌群落16S rRNA的代謝功能進行預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1樣品有效數(shù)據(jù)信息的可分類單元(OTUs)聚類

不同作物間作烤煙根際土壤48份樣品16s RNA的V3～V4區(qū)測序結(jié)果顯示，共獲得3 667 900條有效序列，平均每個樣品得到76 415條有效序列，質(zhì)控有效率達93.77%。有效序列以97%的一致性將可分類單元(OTUs)聚類共得到6584個OTUs。測序深度可全面覆蓋土壤樣品中絕大多數(shù)的細菌信息，能夠較好地反映烤煙根際土壤樣品中細菌的群落多樣性。

2.2細菌的Alpha多樣性

從表1可知，隨著烤煙生長發(fā)育進程的延長，不同作物間作烤煙根際土壤細菌群落的豐富度、多樣性和平均覆蓋度的變化。豐富度：A、B、C、CK的Ace指數(shù)分別為T2>T4>T3>T1、T3>T2>T4>T1、T2>T3>T4>T1和T3>T4>T2>T1，Chao1指數(shù)分別為T2>T4>T3>T1、T3>T4>T2>T1、T2>T3>T4>T1和T3>T4>T1>T2。多樣性：A、B、C、CK的香農(nóng)指數(shù)分別為T4>T2>T3>T1、T4>T3>T2>T1、T4>T2>T3>T1和T2>T4>T3>T1，辛普森指數(shù)分別為T2=T3>T1=T4、T2=T3=T4>T1、T2=T4>T3>T1和T2=T3=T4>T1。平均覆蓋度：A、B、C、CK分別為T1>T3>T4>T2、T1>T4>T2>T3、T1>T4>T3>T2和T2>T1>T4>T3。其中，細菌的豐富度Chao1指數(shù)，T2與T1比，CK下降3.74%，A、B和C分別上升20.22%、6.65%和23.79%；T3與T2比，B和CK分別上升4.49%和8.53%，A和C分別下降11.96%和2.91%；T4與T3比，A上升9.55%，B、C和CK分別下降4.16%、0.91%和2.55%。細菌的群落多樣性，T2與T1比，各處理土樣細菌的群落多樣性均呈上升趨勢，C上升幅度最大，為5.32%；T3與T2比，A、C和CK的細菌群落多樣性均呈小幅下降趨勢，B上升0.30%；T4與T3比，細菌群落多樣性均呈上升趨勢。

表1 不同作物間作烤煙根際土壤細菌的Alpha多樣性

2.3細菌的群落結(jié)構(gòu)

從不同作物間作烤煙根際土壤得到的6 584個OTUs序列進行物種注釋，共有2 480(37.67%)個OTU注釋到屬水平。根據(jù)注釋結(jié)果統(tǒng)計分析，48個土壤樣品共檢測到50個門、58個綱、130個目、237個科和574個屬。

從圖2看出，在門水平上相對豐度列前10位的物種包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，為烤煙根際土壤的主要細菌類群(平均豐度>5%)，高于其他優(yōu)勢菌群，約占總菌群的83.90%，并在烤煙各個生長時期平均豐度均較高。其中，變形菌門的相對豐度在各處理中都隨烤煙生長發(fā)育時期而降低，至T3降至最低，T4上升，各處理無明顯差異；放線菌門的相對豐度 A、B和C都呈波動式變化，T2降至最低、T3升至最高、T4又下降；CK則為T2和T3上升，T4下降，且T3的放線菌門的相對豐度最高；酸桿菌門的相對豐度雖然CK、A和C均為T2升至最高后下降，B至T3升至最高后下降，但各時期酸桿菌門的相對豐度在各處理中的差異不大；擬桿菌門的相對豐度CK隨烤煙生長發(fā)育呈逐漸降低趨勢，A、B和C都在T2達最高，T3呈降低趨勢，T3的降低更明顯，T4的A和C持續(xù)降低，但B呈上升趨勢。

從圖3看出，不同作物間作烤煙根際土壤樣本在屬水平上豐度列前15位的物種中，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、未分類的甲烷球菌類(unidentifiedGammaproteobacteri)、Haliangium、Devosia、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、馬賽菌屬(Massilia)，未分類的酸桿菌類(unidentifiedAcidobacteria)為優(yōu)勢菌屬(相對豐度>1%)。

2.4細菌功能的預(yù)測

經(jīng)Tax4Fun對不同作物間作烤煙根際土壤細菌群落16S rRNA的代謝功能預(yù)測結(jié)果表明，在一級功能層共獲得代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)、細胞過程(Cellular processes)、人類疾病(Human diseases)和有機系統(tǒng)(Organismal systems)六類生物代謝通路功能。其中，屬水平上位列前15細菌的代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理為其功能預(yù)測主要組成，分別占47.22%～48.14%、19.82%～20.78%和13.40%～14.48%。隨烤煙生長發(fā)育，代謝、遺傳信息處理和有機系統(tǒng)占比逐漸上升，T3升至最高，T4下降，環(huán)境信息處理和人類疾病與此相反，隨烤煙生育時期占比逐漸降低，T3降至最低，T4上升，細胞過程占比呈波動式變化，T2和T4呈上升趨勢，T3呈下降趨勢。從圖4看出，二級功能層由44個子功能組成，其中包括碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、膜運輸(Membrane transport)、翻譯(Translation)、復(fù)制和修復(fù)(Replication and repair)、能量代謝(Energy metabolism)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism)、輔助因子與維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)和核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)等。

3結(jié)論與討論

土壤微生物作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，對維持生態(tài)系統(tǒng)平衡起著重要作用。早期對土壤微生物的研究受技術(shù)限制，依賴于人工分離培養(yǎng)技術(shù)，然而土壤中絕大多數(shù)微生物無法在實驗室條件下分離存活。高通測序技術(shù)的發(fā)展，可同時對多種微生物基因組進行測序，相較于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法有助于更好地深入研究微生物與作物生長發(fā)育之間的關(guān)系，為克服連作障礙提供數(shù)據(jù)支撐[17]。隨著下一代測序技術(shù)的迅速發(fā)展與普及，16S rDNA擴增子測序技術(shù)被認為是土壤微生物多樣性研究較好的方法之一?；诎雽?dǎo)體芯片技術(shù)的IonS5TMXL高通量測序已成為研究環(huán)境樣品中微生物群落組成結(jié)構(gòu)及多樣性的重要手段。通過IonS5TMXL高通量測序技術(shù)，研究間作甘薯、丹參和大豆條件下的烤煙根際土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)及多樣性，探討幾種栽培措施對烤煙根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。共獲得3 667 900條有效序列，平均測序深度達76 415條有效數(shù)據(jù)，不同作物間作烤煙根際土壤均達96%以上，平均覆蓋度達97.25%。表明，測序結(jié)果可反應(yīng)樣本的真實情況，該方法也可在包括烤煙在內(nèi)的許多農(nóng)作物領(lǐng)域應(yīng)用。經(jīng)Alpha多樣性分析，不同作物間作烤煙根際土壤具有豐富的群落組成。烤煙不同生長發(fā)育階段的根際土壤細菌群落豐富度和多樣性存在一定的差異性，均在旺長期達最高，與前人的研究結(jié)果一致[18]。間作處理細菌群落豐富度高于單作烤煙處理(對照)，細菌群落多樣性低于對照，與涂勇等[19]研究結(jié)果基本一致。

不同作物間作烤煙根際土壤樣本在屬水平上豐度位列前15的物種中，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、未分類的甲烷球菌類(unidentifiedGammaproteobacteri)、Haliangium(屬)、Devosia(屬)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、馬賽菌屬(Massilia)，未分類的酸桿菌類(unidentifiedAcidobacteria)為優(yōu)勢菌屬(相對豐度>1%)，與前人[20]研究結(jié)果相近。在門水平上，間作相較單作烤煙根際土壤微生物放線菌門的相對豐度降低，變形菌門和擬桿菌門的相對豐度提高。在屬水平上，間作烤煙際土壤Devosia、Rhodanobacter、假單胞菌屬(Pseudomonas)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)相對豐度降低，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、鞘脂菌屬(Sphingobium)和未分類門的甲烷球菌的相對豐度提高。表明間作一定程度上改變了烤煙根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。

在相同環(huán)境條件下，微生物群落的功能相似，但行使功能的微生物組成可能存在很大差異。表明，外界環(huán)境因子與土壤中微生物群落的功能組成之間的相關(guān)度大于外界環(huán)境因子與群落組成之間的相關(guān)度。所以，在分析土壤環(huán)境與微生物群落組成的基礎(chǔ)上對揭示微生物群落的功能顯得尤為重要。齊澤明等[21-23]研究發(fā)現(xiàn)，植物根系在植株生長發(fā)育過程中不斷向周圍釋放大量的分泌物，這些次生代謝產(chǎn)物會改變根際環(huán)境，導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系發(fā)生變化，并受植物生長發(fā)育階段的影響。從采集到的土壤樣品基于細菌群落16s RNA功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，隨著烤煙生長發(fā)育進程的推進，行使代謝、遺傳信息處理和有機系統(tǒng)的功能基因逐漸上升，在烤煙旺長期達最高，成熟期降低；環(huán)境信息處理和人類疾病與此相反，隨烤煙生育時期逐漸降低，旺長期達最低，成熟期上升；細胞過程占比呈波動式變化，伸根期和成熟期上升，旺長期下降。推測：可能與烤煙根系在各生育時期的分泌物差異有關(guān)。間作處理中，行使代謝功能類別中編碼萜類化合物、聚酮類化合物、異生素生物降解、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝的功能基因減少；編碼酶家族和糖的生物合成和代謝的功能基因有少量增加；行使遺傳信息處理功能類別中編碼翻譯、折疊、分類和降解的功能基因減少；行使環(huán)境信息處理功能類別中編碼細胞膜運輸?shù)墓δ芑蛟黾?；行使細胞過程類別中編碼細胞運動的功能基因增加。可能是因為間作作物根系分泌的次生代謝產(chǎn)物導(dǎo)致周圍土壤環(huán)境發(fā)生變化，即改變了烤煙根際土壤的微生物區(qū)系，從而影響根際土壤微生物群落的功能。此外，間作處理下烤煙根際群落結(jié)構(gòu)及其功能隨著生育期的推進，與單作烤煙根際群落結(jié)構(gòu)及其功能變化趨同。說明，與間作因素相比，烤煙的生育期是影響根際群落結(jié)構(gòu)及功能的主要因素。

研究結(jié)果基本揭示了烤煙與甘薯、丹參和大豆間作土壤細菌的多樣性及其功能的變化，可為今后研究烤煙連作障礙提供參考，但由于研究中稀釋曲線即測序深度并未達到飽和，處理中也還有部分細菌種群未被發(fā)現(xiàn)。因此，研究結(jié)果僅能代表各個土樣中的大部分細菌種群，更深層次的研究仍有待開展。