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    響應(yīng)面法優(yōu)化外源因子對(duì)酵母菌的油脂代謝研究

    2020-06-02 05:35:38陳韻陸麗珠張瑾梁舒妍江志彬王漫君鐘先鋒
    食品研究與開發(fā) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:檸檬酸鈉乙酸鈉甘油

    陳韻,陸麗珠,張瑾,梁舒妍,江志彬,王漫君,鐘先鋒

    (佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東佛山528225)

    當(dāng)今社會(huì)的快速發(fā)展,使得人類所面臨的能源和環(huán)境壓力日益增大,為解決這個(gè)問題,各國(guó)均在努力多渠道開發(fā)可再生生物質(zhì)資源。生物柴油因其具有可再生、環(huán)境友好、與柴油成分相近等優(yōu)點(diǎn)成為解決此問題的熱點(diǎn)研究方向[1]。目前用于生物柴油生產(chǎn)的原料主要是動(dòng)植物油脂、餐飲地溝油等[2-3]。但動(dòng)植物油脂成本較高,且供給有限,限制了生物柴油規(guī)?;a(chǎn)[4-7]。產(chǎn)油微生物中酵母菌油脂脂肪酸組成與植物油相似,且含量高,是代替動(dòng)植物油脂成為制備生物柴油的重要原料[6,8-9]。與植物油和動(dòng)物油生產(chǎn)相比,微生物細(xì)胞生長(zhǎng)十分迅速、生長(zhǎng)周期較短,同時(shí)微生物生長(zhǎng)所需原料來源比較廣泛,具有利用一些農(nóng)業(yè)廢棄物的水解物作為生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力,能夠解決能源短缺問題的同時(shí)還有利于環(huán)境保護(hù)[10-12]。

    微生物油脂的合成都是從乙酰輔酶A的合成開始,再經(jīng)過多次碳鏈延長(zhǎng)后,在去飽和酶的去飽和作用下,最終生成油脂[13]。在油脂合成的過程中,添加脂肪酸合成過程中所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物,或能影響脂肪酶活性的物質(zhì),如乙酸鹽、甘油等,以及某些維生素B類物質(zhì),可提高油脂的含量[13]。本研究以充分利用木質(zhì)纖維且進(jìn)一步生產(chǎn)微生物油脂為目的,采用響應(yīng)面優(yōu)化法研究添加外源因子對(duì)酵母菌產(chǎn)油脂代謝的影響,通過因素交互作用分析,建立響應(yīng)面回歸模型,對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化,以確定各外源因子的最佳添加配方,以期加快利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)微生物油脂的工業(yè)進(jìn)程。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 菌種

    圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CICC 32489:中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

    玉米秸稈:佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    固體培養(yǎng)基:5°Bé麥芽汁 1.0 L,瓊脂 15.0 g,自然pH值。

    種子培養(yǎng)基:KH2PO41 g/L,MgSO41.5 g/L,(NH4)2SO40.5 g/L,酵母粉2 g/L,葡萄糖4 g/L,自然pH值。

    玉米秸稈水解液的培養(yǎng)基:KH2PO41 g/L,MgSO41.5 g/L,(NH4)2SO40.5 g/L,酵母粉 2 g/L。

    以上培養(yǎng)基均要在121℃,0.1MPa下滅菌20min。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌種培養(yǎng)

    斜面培養(yǎng):將已活化的菌種接種到固體培養(yǎng)基中,在28℃,180 r/min的條件下培養(yǎng)2 d。

    種子培養(yǎng):將斜面培養(yǎng)基中菌種接種幾環(huán)到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,在28℃,180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后,得到種子液。

    產(chǎn)脂發(fā)酵:將上述得到的種子液接種到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)1 d~12 d。

    1.2.2 玉米秸稈粗水解液的制備

    稱取80 g玉米秸稈粉末,置于1 000 mL三角瓶中,加入800 mL濃度0.5%的稀硫酸,振蕩搖勻,121℃預(yù)處理90 min,冷卻后調(diào)節(jié)pH值至5.5,再加入2.5%纖維素酶和木聚糖酶混合物(1∶1,質(zhì)量比),50℃水解48 h后,離心取上清液,得玉米秸稈粗水解液。

    1.2.3 玉米秸稈水解液脫毒處理

    向粗水解液中加入Ca(OH)2粉末,調(diào)節(jié)pH值至10,靜置1.5 h,過濾,除去水解液中的沉淀。濾液用5 mol/L的H2SO4調(diào)節(jié)pH值到5.5,靜置1 h后過濾取上清液,然后沸水浴20 min,待其冷卻后過濾備用。

    向經(jīng)脫毒處理的玉米秸稈水解液中添加KH2PO41 g/L,MgSO41.5 g/L,(NH4)2SO40.5 g/L,CaCl20.5 g/L,酵母粉2 g/L,制備利于微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的玉米秸稈水解液培養(yǎng)基。

    1.2.4 生物量的測(cè)定

    發(fā)酵液在4 000 r/min離心10 min,收集菌體在105℃烘干至恒重。

    1.2.5 油脂含量、油脂產(chǎn)量測(cè)定

    將發(fā)酵液離心收集菌體,每克濕菌體加入10 mL濃度4 mol/L的鹽酸,振蕩搖勾,室溫(25℃)放置半小時(shí)后,沸水浴10 min,-20℃冷凍30 min。加入乙醚和石油醚的混合液20 mL(體積比為1∶1)振蕩搖勻,4 000 r/min離心10 min,萃取有機(jī)層。再加入乙醚和石油醚的混合液,重復(fù)上述步驟,合并有機(jī)層,混合后離心,揮發(fā)機(jī)層。于105℃,烘至恒重,冷卻后計(jì)算油脂含量和油脂產(chǎn)量。

    1.2.6 總糖測(cè)定

    試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14]的方法,采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定培養(yǎng)基中還原糖濃度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得到線性回歸方程y=0.486x+0.001 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

    1.2.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    分別添加不同濃度的甘油(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、乙酸鈉(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、檸檬酸鈉(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、維生素B6(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)至玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中,考察了4種外源因子對(duì)酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)油脂的影響。

    1.2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以乙酸鈉(A)、維生素B6(B)、甘油(C)、檸檬酸鈉(D)為自變量,以生物量(Y1)、油脂含量(Y2)、油脂產(chǎn)量(Y3)為響應(yīng)值,使用 Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),因子編碼及水平見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factor and levels in response surface analysis

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Office Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析,Design-Expert 8.0.6軟件,Origin 9.0軟件等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖。單因素試驗(yàn)中用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行方差分析處理,處理后采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行比較,并使用字母標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酵母菌發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂

    采用酸水解結(jié)合酶解的方法制備玉米秸稈水解液培養(yǎng)基,3,5-二硝基水楊酸法測(cè)到培養(yǎng)基的總糖為24.332 g/L。將種子液接種到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d,測(cè)到生物量為18.79 g/L、油脂含量30.31%、油脂產(chǎn)量5.70 g/L。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 甘油對(duì)酵母產(chǎn)油脂的影響

    甘油在磷酸化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛椭铣伤枰?-磷酸甘油,從而為油脂提供合成的前體[15]。甘油對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響見圖1。

    圖1 甘油對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of glycerin on biomass,lipid content and lipid yield of bacteria

    由圖1可知,當(dāng)添加0.1%~0.5%甘油時(shí),生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量都呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì),在甘油添加量為0.3%時(shí)有最大值,分別為生物量20.12 g/L、油脂含量30.68%、油脂產(chǎn)量6.17 g/L。隨著甘油濃度增大,以上指標(biāo)均下降,原因可能是加入過量甘油后培養(yǎng)基在搖瓶培養(yǎng)的過程中容易起泡,泡沫過多會(huì)影響到培養(yǎng)基中氧氣的溶解度,最終會(huì)影響菌體油脂的積累[16]。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià),選擇添加甘油0.20%~0.40%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

    2.2.2 乙酸鈉對(duì)酵母產(chǎn)油脂的影響

    乙酸鈉可促進(jìn)無活性的單體聚合成有活性的全酶,從而加速脂肪酸的合成。乙酸鈉中含有的乙?;芎洼o酶A結(jié)合,轉(zhuǎn)化生成的乙酰輔酶A是脂肪酸合成和能量代謝的重要前體,因而可以為脂肪酸合成提供更多的底物供應(yīng)[17-18]。乙酸鈉對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響見圖2。

    圖2 乙酸鈉對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of sodium on biomass,lipid content and lipid yield of bacteria

    由圖2可知,乙酸鈉添加量0.1%~0.3%,生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量均增加,在0.3%時(shí)有最大值,分別為17.28 g/L、30.26%、5.23 g/L。當(dāng)添加量超過0.3%時(shí),生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量都顯著減小。原因可能是乙酸鈉添加過量會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值,從而影菌體的正常的生長(zhǎng)[17]。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià),選擇添加乙酸鈉0.20%~0.40%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

    2.2.3 檸檬酸鈉對(duì)酵母產(chǎn)油脂的影響

    乙酰輔酶A是微生物在體內(nèi)積累油脂的必備因子,它主要存在于線粒體中,而脂肪酸的合成是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),乙酰輔酶A以檸檬酸的形式通過三羧酸循環(huán)系統(tǒng)從線粒體運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中,其中檸檬酸作為重要的中間產(chǎn)物,對(duì)油脂的合成起著重要的作用[19]。Brown等[20]研究表明檸檬酸是脂肪酸合成的主要前體物質(zhì),是油脂合成啟動(dòng)的源頭。研究檸檬酸鈉添加量對(duì)酵母菌產(chǎn)油脂的影響結(jié)果見圖3。

    圖3 檸檬酸鈉對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of sodium citrate on biomass,lipid content and lipid yield of bacteria

    如圖3所示,加入一定量的檸檬酸鈉,菌體的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量等升高,但加入過量時(shí)以上指標(biāo)均下降,原因可能是檸檬酸鈉作為一種鹽類,加入過量時(shí)對(duì)菌體表面細(xì)胞膜產(chǎn)生負(fù)面影響,從而影響菌體對(duì)培養(yǎng)基中離子的吸收利用。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià),選擇添加檸檬酸鈉0.40%~0.80%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

    2.2.4 維生素B6對(duì)酵母產(chǎn)油脂的影響

    丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,Pyc)是胞質(zhì)還原三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA循環(huán))途徑中的關(guān)鍵酶,它通過CO2固定催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,而如果體系中沒有足夠的草酰乙酸參與到檸檬酸的合成,檸檬酸的缺乏會(huì)成為油脂合成的限速步驟[21]。因此,Pyc在脂肪酸的生物合成中發(fā)揮重要作用,維生素B6提高Pyc的活性,減少丙酮酸的積累,最終促進(jìn)油脂的合成[22-23]。同時(shí),維生素B6是脫氫酶的輔酶,它能提高脫飽和酶的活性,促進(jìn)脂肪酸脫氫生成雙鍵,最終能夠提高脂肪酸的不飽和度[24]。維生素B6對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響見圖4。

    如圖4所示,當(dāng)維生素B6添加量0.01%到0.05%,菌體生物量在14.96 g/L到16.16 g/L變化,在添加量為0.04%時(shí)有最大值16.16 g/L,變化幅度不大,說明添加維生素B6對(duì)圓紅冬孢酵母菌體的生長(zhǎng)影響不明顯。在添加量為0.02%時(shí),油脂含量、油脂產(chǎn)量最大,分別為31.26%、4.6 g/L,說明添加適量維生素B6是有助于菌體發(fā)酵產(chǎn)油脂。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià),選擇添加維生素B60.01%~0.03%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

    圖4 維生素B6對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of vtamin B6on biomass,lipid content and lipid yield of bacteria

    2.3 響應(yīng)面優(yōu)化外源因子對(duì)微生物產(chǎn)油脂的影響

    在單因素試驗(yàn)結(jié)的基礎(chǔ)上,使用Design-Expert 8.0.6軟件建立數(shù)學(xué)模型,以生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量為響應(yīng)值,共設(shè)計(jì)了29個(gè)處理組,試驗(yàn)結(jié)果見表2。

    表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

    續(xù)表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Continue table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

    2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立和分析

    利用Design-Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和方差分析,得到各因子對(duì)響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為:

    回歸方程模型方差分析(生物量)見表3,回歸方程模型方差分析(油脂含量)見表4,回歸方程模型方差分析(油脂產(chǎn)量)見表5。

    表3 回歸方程模型方差分析(生物量)Table 3 ANOVA for response surface quadratic model(biomass)

    表4 回歸方程模型方差分析(油脂含量)Table 4 ANOVA for response surface quadratic model(lipid content)

    續(xù)表4 回歸方程模型方差分析(油脂含量)Continue table 4 ANOVA for response surface quadratic model(lipid content)

    表5 回歸方程模型方差分析(油脂產(chǎn)量)Table 5 ANOVA for response surface quadratic model(lipid yied)

    方差分析結(jié)果顯示,模型的p值均<0.01,差異極顯著,而失擬項(xiàng)p值分別為0.785 3、0.175 3、0.624 3(p>0.05),差異不顯著,說明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小,該試驗(yàn)?zāi)P统浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù),即可以利用此回歸模型反映各因素對(duì)菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響。

    在表3回歸方程模型方差分析(生物量)中,A、B、C、D、A2、B2、C2、D2影響均為極顯著(p<0.01),交互項(xiàng)AB 影響顯著(p<0.05),CD 影響極顯著(p<0.01)。根據(jù)F值對(duì)各因素的影響大小順序?yàn)椋篋>C>A>B,說明檸檬酸鈉對(duì)圓紅冬孢酵母生物量大小影響最大。

    在表4回歸方程模型方差分析(油脂含量)中,交互項(xiàng) AB、AC、AD、BC、BD、CD 的交互作用對(duì)響應(yīng)值沒有顯著影響,而一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)圓紅冬孢酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基的油脂含量的影響均為極顯著(p<0.01),根據(jù)F值大小,一次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響大小順序?yàn)椋篋>B>A>C。

    在表5回歸方程模型方差分析(油脂產(chǎn)量)中,A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值影響均為極顯著 (p<0.01),A、B、C、D 各因素對(duì)酵母菌油脂產(chǎn)量的顯著性大小依次為:D>B>C>A。交互項(xiàng)AD、CD對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(p<0.01),BD 影響顯著(p<0.05)。

    乙酸鈉、維生素B6、甘油、檸檬酸鈉對(duì)菌體發(fā)酵玉米秸稈水解液產(chǎn)油脂影響顯著。

    2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

    響應(yīng)面坡度越陡峭,等高線越密集并形成橢圓,說明兩因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用越顯著,反之則越不顯著[25]。圖5為各因素對(duì)菌體生物量的響應(yīng)面分析圖。

    圖5 各因素對(duì)生物量的響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to biomass

    由圖5可見,結(jié)合表3方差分析結(jié)果,檸檬酸鈉和甘油的交互作用極顯著(p<0.01),控制檸檬酸鈉濃度不變,隨著甘油濃度增大,生物量呈先上升后下降的趨勢(shì),檸檬酸鈉也是如此;維生素B6和乙酸鈉的交互作用顯著(p<0.05),生物量隨著兩者增大,表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì),與方差分析結(jié)果一致。圖6為各因素對(duì)菌體油脂含量的響應(yīng)面分析圖。

    圖6 各因素對(duì)油脂含量的響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid content

    由圖6可見,6組響應(yīng)面立體分析圖的坡度都較陡,說明乙酸鈉、維生素B6、檸檬酸鈉、甘油等濃度增大都會(huì)使酵母的油脂含量產(chǎn)生顯著性的先增大后減小的變化趨勢(shì)。結(jié)合表4的方差分析結(jié)果,各因素間的交互作用對(duì)菌體油脂含量影響均不顯著(p>0.05),但各因素對(duì)酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂影響顯著。圖7為各因素對(duì)菌體油脂產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖。

    由圖7可見,響應(yīng)面立體分析圖的坡度較陡,說明各因素對(duì)酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂影響顯著。各響應(yīng)值隨著各因素在一定范圍內(nèi)變化,均表現(xiàn)出是先增大再減少的變化趨勢(shì),說明在研究的因素水平范圍內(nèi)有最大值,結(jié)合表5回歸模型方差分析結(jié)果,檸檬酸鈉和乙酸鈉、甘油的交互作用影響極顯著(p<0.01),維生素B6和檸檬酸鈉的交互作用影響顯著(p<0.05)。

    圖7 各因素對(duì)油脂產(chǎn)量的響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid yield

    2.3.3 最佳添加量驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

    通過Design-Expert8.0.6軟件分析得到各外源因子添加量的最佳配方為乙酸鈉0.33%、維生素B60.02%、甘油0.27%、檸檬酸0.66%,在此條件下,模型預(yù)測(cè)的生物量為28.82 g/L、油脂含量為43.18%、油脂產(chǎn)量為11.55 g/L。為了方便實(shí)際試驗(yàn)操作,將試驗(yàn)條件調(diào)整為乙酸鈉0.35%、維生素B60.02%、甘油0.3%、檸檬酸0.65%,得到的生物量為(29.32±0.35)g/L、油脂含量為(43.75±0.26)%、油脂產(chǎn)量為(12.11±0.18)g/L,相比優(yōu)化前分別提高了56.04%、41.95%、109.15%,試驗(yàn)結(jié)果偏差較小,數(shù)據(jù)穩(wěn)定,證明該模型合理可靠。

    3 結(jié)論

    為進(jìn)一步提高圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)CICC 32489菌株的油脂產(chǎn)量,本課題研究了外源因子對(duì)菌體生物量和產(chǎn)油脂情況的影響,先通過單因素試驗(yàn),確定外源因子的最佳添加量,在此基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)乙酸鈉、甘油、維生素B6、檸檬酸鈉等4個(gè)因子進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,得到的工藝參數(shù)為乙酸鈉0.33%、維生素B60.02%、甘油0.27%、檸檬酸鈉0.66%,生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量等相比優(yōu)化前分別提高了56.04%、41.95%、109.15%,說明4種外源因子對(duì)酵母菌發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂影響顯著。

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