固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定紅糖中有機(jī)酸

陳其釗，陳嘉敏，陳紅香，*，王桂華，李家威，余構(gòu)彬

（1.廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2.國(guó)家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣東廣州510316）

傳統(tǒng)紅糖，又名古法紅糖、原生態(tài)紅糖，是甘蔗榨汁后經(jīng)石灰法清凈處理，直接煮制而成，整個(gè)過(guò)程中不加入任何化學(xué)試劑及食品添加劑，幾乎完全保留甘蔗原有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。紅糖在我國(guó)歷史悠久，一直享有健脾養(yǎng)胃、溫中補(bǔ)氣、緩解精通的溫補(bǔ)美譽(yù)，常用作滋補(bǔ)食材。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究亦表明，紅糖中的非糖成分具有防齲齒、抗毒素、抗癌以及抗氧化等作用[1-7]。紅糖中含有大量的甘蔗原生態(tài)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8]，包括礦物質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、酚類(lèi)物質(zhì)以及維生素等。其中，有機(jī)酸的存在不僅構(gòu)成紅糖的風(fēng)味成分，而且可以使紅糖保持較低的pH值，抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。國(guó)內(nèi)外有關(guān)于研究紅糖有機(jī)酸的文獻(xiàn)都很少，多集中于測(cè)定紅糖及紅糖原料甘蔗中的有機(jī)酸種類(lèi)和含量，目前人們已經(jīng)從紅糖中檢測(cè)出含有多種有機(jī)酸，包括草酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、烏頭酸、沒(méi)食子酸、乳酸以及富馬酸等[9-11]，國(guó)內(nèi)對(duì)于有機(jī)酸的研究多以甘蔗發(fā)酵液[11]、果汁[12]、乳制品[13]、蜂蜜[14]、茶葉[15]和米酒[16]等為研究對(duì)象。對(duì)于復(fù)雜基體樣品多采用固相萃取法對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行富集處理且效果良好，常用的分析方法主要為離子色譜法[17-19]、氣相色譜法[20-21]以及高效液相色譜法[22-23]等。有機(jī)酸的種類(lèi)和含量是影響紅糖質(zhì)量好壞的一個(gè)重要因素，建立一種可同時(shí)測(cè)定紅糖中多種有機(jī)酸的方法，可用于快速準(zhǔn)確檢測(cè)紅糖中的有機(jī)酸種類(lèi)和含量，為紅糖的質(zhì)量評(píng)價(jià)、紅糖的開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)依據(jù)。本文建立固相萃取-反相高效液相色譜測(cè)定紅糖有機(jī)酸的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)測(cè)定紅糖中的7種有機(jī)酸，并為紅糖的質(zhì)量控制提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；優(yōu)普UPC-I-60L去離子水系統(tǒng)：四川優(yōu)普超純科技有限公司；CNWBOND SAX強(qiáng)陰離子交換固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）小柱（200 mg/6 mL）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；CL5R醫(yī)用離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；S22H型超聲提取儀：致微（廈門(mén)）儀器有限公司；FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

酒石酸（≥99.0%）、丙酮酸（≥95.0%）、乙酸（≥99.7%）、檸檬酸（≥99.5%）、琥珀酸（≥99.0%）、沒(méi)食子酸（≥98.0%）、烏頭酸（≥98.0%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磷酸（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；試驗(yàn)用水均由超純水系統(tǒng)制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：XBridge C8柱（4.6×250 nm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%H3PO4與乙腈，比例 99 ∶1；流速：0.7 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣 20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱(chēng)取10 mg酒石酸、丙酮酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸、烏頭酸7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用去離子水溶解并定容，于4℃下避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取適量部分上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用去離子水配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為：酒石酸20 mg/L、丙酮酸6 mg/L、乙酸70 mg/L、檸檬酸50 mg/L、琥珀酸60 mg/L、沒(méi)食子酸0.7 mg/L、烏頭酸3 mg/L。

1.3.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取紅糖樣品10g，加入去離子水?dāng)嚢枞芙?，并定容?5 mL，搖勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。

CNWBOND SAX SPE小柱依次用3 mL甲醇，3 mL去離子水活化平衡，備用。取離心后的上清液10 mL全部過(guò)柱，控制流速在1 mL/min左右，用2 mL去離子水淋洗棄掉全部上樣流出液以及淋洗流出液；用2 mL 1%H3PO4洗脫，收集所有洗脫液于25 mL離心管，混勻后過(guò)0.22 μm水相濾膜，濾液收集于進(jìn)樣小瓶備用于高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPE條件的優(yōu)化

2.1.1 SPE柱的選擇

本文分別考察Waters Oasis WAX、Cleanert PAXSPE、poly-sery MAX SPE以及CNWBOND SAX SPE這4種陰離子交換柱對(duì)紅糖的凈化富集效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)果如圖1所示，弱陰離子交換柱Waters Oasis WAX與Cleanert PAX-SPE柱的凈化效果較好，能較好減少雜質(zhì)峰的干擾，而混合型弱陰離子poly-sery MAX SPE柱的凈化效果較差；3種陰離子交換柱對(duì)有機(jī)酸的吸附作用不強(qiáng)，乙酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸以及檸檬酸的回收率無(wú)法達(dá)到試驗(yàn)要求，且均不能保留丙酮酸和烏頭酸。強(qiáng)陰離子交換柱CNWBOND SAX SPE對(duì)紅糖的凈化效果以及對(duì)有機(jī)酸的保留能力都優(yōu)于弱陰離子交換柱，能同時(shí)保留7種有機(jī)酸且回收率滿足試驗(yàn)要求，因此本試驗(yàn)擇優(yōu)選擇SAX固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化富集處理。

圖1 4種SPE柱選擇色譜圖Fig.1 Chromatogram of SPE column selection

2.1.2 洗脫劑的選擇

理論上用一定pH值的酸性溶液即可將保留在陰離子柱上的有機(jī)酸洗脫下來(lái)，本試驗(yàn)考察6%鹽酸溶液與0.1%磷酸溶液對(duì)7種有機(jī)酸的洗脫效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 洗脫溶劑選擇色譜圖Fig.2 Elution solvent selection chromatogram

結(jié)果如圖2所示，用6%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，由于洗脫液強(qiáng)度大，有機(jī)酸洗脫的同時(shí)，在酒石酸的位置上會(huì)出現(xiàn)一些干擾，同時(shí)乙酸的回收率也不太好。用0.1%磷酸溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，則需要增大洗脫體積；綜合兩種洗脫劑的洗脫情況考慮，嘗試提高磷酸濃度至1%，試驗(yàn)表明以1%磷酸作為洗脫劑時(shí)，7種有機(jī)酸的回收率良好。同時(shí)從圖中可以看到對(duì)于酒石酸無(wú)論選用何種凈化柱，洗脫溶液始終存在干擾，因此無(wú)法做準(zhǔn)確定量。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

為了使有機(jī)酸能以分子的形式穩(wěn)定存在，一般使用pH值較低的流動(dòng)相。本試驗(yàn)考察3種流動(dòng)相對(duì)有機(jī)酸的分離，分別為0.1%磷酸、0.1 mol/L磷酸二氫鈉以及0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明：以0.1 mol/L磷酸二氫銨溶液作流動(dòng)相時(shí)，多種有機(jī)酸擠在一起出峰，無(wú)法分離；比較0.1%磷酸與0.1 mol/L磷酸二氫鈉發(fā)現(xiàn)，以0.1%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)，7種有機(jī)酸的分離度較好，綜合有機(jī)酸分離情況考慮，以0.1%磷酸作為流動(dòng)相為宜。

2.2.2 色譜柱的選擇

本文選擇考察3種不同品牌色譜柱，分別為E－clipse Plus C18柱、Venusil XBP C18柱以及 XBridge C8柱。結(jié)果表明：Eclipse Plus C18柱和XBridge C8柱分離有機(jī)酸的情況良好，Venusil XBP C18柱不能有效分離各有機(jī)酸，多種有機(jī)酸峰擠在一起。綜合有機(jī)酸分離情況以及色譜柱成本考慮，放棄使用Venusil XBP C18柱，進(jìn)一步考察Eclipse Plus C18柱和XBridge C8柱分離7種有機(jī)酸的情況。Eclipse Plus C18柱無(wú)法將烏頭酸與琥珀酸分離，且酒石酸出峰時(shí)間與溶劑峰出峰時(shí)間相差較小，容易發(fā)生峰形基線重疊。XBridge C8柱能有效分離7種有機(jī)酸，各有機(jī)酸峰形良好且分離度滿足試驗(yàn)要求，綜合考慮，本試驗(yàn)選擇XBridge C8柱作為試驗(yàn)用色譜柱。

2.2.3 流速與柱溫的優(yōu)化

根據(jù)以上流動(dòng)相以及色譜柱考察，基本確定流動(dòng)相為0.1%磷酸∶乙腈=99∶1，色譜柱為XBridge C8柱，在此條件下，本試驗(yàn)考察1、0.5、0.7 mL/min的流速對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同流速下7種有機(jī)酸分離的色譜圖Fig.3 Separation chromatogram of seven organic acids at different flow rates

比較試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)流速為1mL/min時(shí)，各有機(jī)酸組分保留時(shí)間縮短，峰形良好，分析時(shí)間在12 min以內(nèi)，但流速過(guò)高，泵的壓力也明顯升高，導(dǎo)致基線不穩(wěn)且容易降低柱子的使用壽命；而流速為0.5 mL/min時(shí)，琥珀酸與沒(méi)食子酸基線分離不完全，峰部分重疊；流速為0.7 mL/min時(shí)，7種有機(jī)酸能有效的分離且峰形均良好，20min內(nèi)能完成分析。綜合考慮有機(jī)酸分離度、分析時(shí)間以及基線穩(wěn)定情況，確定0.7 mL/min的流速為宜。

在上述已確定的色譜條件下，考察30、35、40、45℃的柱溫，結(jié)果表明柱溫對(duì)各有機(jī)酸的保留時(shí)間以及分離度有明顯的影響：溫度高，出峰時(shí)間前移，有機(jī)酸分離度降低；溫度低，出峰時(shí)間后移，分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且柱溫過(guò)高或過(guò)低都不能實(shí)現(xiàn)對(duì)琥珀酸和沒(méi)食子酸的分離；柱溫為35℃時(shí)，7種有機(jī)酸全部出峰，且琥珀酸與沒(méi)食子酸分離情況良好，20 min內(nèi)可完成色譜分析，符合試驗(yàn)要求，故確定柱溫為35℃。圖4為7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品在上述已確定條件下的色譜圖。

圖4 7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography chromatogram of the mixed standard solution on of 7 organic acids

2.3 線性關(guān)系、檢出限及線性范圍

精確移取一定體積的7種有機(jī)酸儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶，加去離子水定容，配制成較高濃度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將其分別稀釋1.5倍、2.5倍、5倍、10倍，配成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.2節(jié)所述色譜條件進(jìn)樣20 μL分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以S/N=3和S/N=10分別確定各有機(jī)酸在樣品中的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 7種有機(jī)酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限（S/N=3）Table 1 Linear ranges，regressions，correlation coefficients and detection limits of 7 organic acids（S/N=3）

2.4 精密度和回收率

按1.2節(jié)所述色譜條件進(jìn)行三水平加標(biāo)試驗(yàn)，每一加標(biāo)水平平行測(cè)定3次，計(jì)算各有機(jī)酸回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 7種有機(jī)酸的回收率及精密度（n=3）Table 2 Recoveries and precision of 7 organic acids（n=3）

續(xù)表2 7種有機(jī)酸的回收率及精密度（n=3）Continue table 2 Recoveries and precision of 7 organic acids（n=3）

7種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為82.1%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.0%。表明該方法各有機(jī)酸的回收率較為穩(wěn)定，精密度良好，可以滿足樣品中種有機(jī)酸的同時(shí)測(cè)定。

2.5 樣品分析

2.5.1 紅糖樣品分析

按照1.2的色譜條件，對(duì)由企業(yè)提供的10個(gè)紅糖樣品進(jìn)行了有機(jī)酸含量的檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 10個(gè)紅糖樣品中7種有機(jī)酸的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 3 Determination results of 7 organic acids in 10 brown sugar samples mg/kg

由表3可知，紅糖樣品中檢出的有機(jī)酸包括丙酮酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸和烏頭酸，但不同樣品之間在有機(jī)酸組成及含量上存在明顯差別。其中乙酸、沒(méi)食子酸，烏頭酸所有樣品均有檢出，尤其是烏頭酸含量最高可達(dá)7 778.4 mg/kg。說(shuō)明紅糖中有機(jī)酸主要以烏頭酸的形式存在。丙酮酸，檸檬酸，琥珀酸的含量則差異很大；酒石酸未檢出。這些可能與甘蔗產(chǎn)地以及各個(gè)廠家的工藝有關(guān)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化富集紅糖有機(jī)酸的SPE條件以及7種有機(jī)酸分離的色譜條件，所建立的固相萃取-高效液相色譜法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可快速準(zhǔn)確測(cè)定紅糖中的7種有機(jī)酸含量，該色譜法還可為建立其他食品中有機(jī)酸含量的檢測(cè)方法提供參考。