宣木瓜抑菌特性及其飲料的活性成分研究

商亞芳，苗俊豪，張一格，曹衡，蔡華珍，賈小麗，步顯勇，謝艷，魏兆軍，*

（1.滁州學(xué)院滁州學(xué)院博士后工作站，安徽滁州239000；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009；3.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239000；4.安徽盼盼食品有限公司，安徽滁州239000）

宣木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]果實(shí)，習(xí)稱“皺皮木瓜”，是安徽省宣城市的道地藥材，是我國(guó)特有的藥食兩用保健型水果。中醫(yī)認(rèn)為木瓜有舒筋、活絡(luò)、健脾開(kāi)胃、舒肝止痛、祛風(fēng)除濕之功效[1]。已有研究表明，宣木瓜中含有糖類、齊墩果酸、熊果酸、有機(jī)酸、黃酮類等物質(zhì)，具有保肝、抗炎鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功效[2-14]。利用水和乙醇溶液提取獲得的宣木瓜粗提物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等有害菌具有抑制作用，但抑菌活性成分的分布尚未明確[15]。本研究以宣木瓜為研究對(duì)象，利用平板打孔法逐步篩選抑菌活性成分，明確具有抑菌活性的成分在宣木瓜粗提物中的分布。宣木瓜由于口感酸澀，不能直接作為新鮮水果食用，果脯由于含有較高糖分能夠掩蓋其酸澀口感，成為宣木瓜果實(shí)的重要加工產(chǎn)品。當(dāng)?shù)鼐用裢ㄟ^(guò)水浸泡宣木瓜的方法降低其酸澀口感，制作宣木瓜即食飲料食用新鮮的宣木瓜果實(shí)，宣木瓜果實(shí)經(jīng)水長(zhǎng)時(shí)間浸泡后會(huì)損失大量的水溶性活性成分，降低宣木瓜的食用價(jià)值。本研究利用乳酸菌發(fā)酵宣木瓜，進(jìn)行宣木瓜飲料的開(kāi)發(fā)，該產(chǎn)品保留了宣木瓜的所有有效成分，利用宣木瓜中含有大量有機(jī)酸及抑菌活性成分的特性，不添加任何防腐劑和色素等食品添加劑，口感微酸，風(fēng)味宜人，具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。本研究重點(diǎn)考察了宣木瓜飲料在冷藏過(guò)程中，內(nèi)部活性成分包括多糖、三萜、黃酮、多酚類化合物及抗氧化活性的變化，為研究宣木瓜飲料成品在冷藏過(guò)程中的穩(wěn)定性奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣木瓜：宣城市宣海棠食品有限公司；乳酸菌：北京日創(chuàng)電器；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylocaccus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由合肥工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；槲皮素、熊果酸、維生素C、兒茶素等（均為色譜純）：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品檢定研究所；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿均為分析純，培養(yǎng)基原輔料均為化學(xué)純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z型MODEL生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JYZ-V907九陽(yáng)榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DFT-100多功能中藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300 VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器公司；SPX－150B－Z型MODEL生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX－40型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；pH計(jì)：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；E－poch2酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取宣木瓜提取物

將宣木瓜干制品烘干至水分小于5%后粉碎，過(guò)40目篩，密封備用。稱取10 g宣木瓜粉，按料液比1 ∶15（g/mL）加入 70%乙醇 150 mL，進(jìn)行回流提取，提取時(shí)間為3 h獲得提取液，經(jīng)離心后，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得宣木瓜提取物固態(tài)浸膏4.0 g。

1.3.2 宣木瓜抑菌試驗(yàn)

將宣木瓜提取物配置成濃度為0.5 g/mL的粗提物原液。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備：取牛肉膏，氯化鈉各1 g，胰蛋白胨2 g，瓊脂4 g加入水200 mL，溶解后，放入高壓滅菌鍋，121℃，滅菌20 min。

1.3.3 菌懸液的制備

將冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在無(wú)菌條件下劃線接種至平板培養(yǎng)基，在37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h；轉(zhuǎn)接2次，得到長(zhǎng)勢(shì)良好的菌種，置于0℃～4℃下冷藏備用。分別挑取各菌種經(jīng)24 h活化培養(yǎng)后的單菌落在無(wú)菌條件下接種至已滅菌的含有100 mL液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，酵母菌和黑曲霉菌在28℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，采用平板計(jì)數(shù)法使其菌懸液濃度大約為106CFU/mL～107CFU/mL，存放于4℃的冰箱中保存[16]。

1.3.4 牛津杯抑菌試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法[17-18]，稍作改動(dòng)，每組做3個(gè)平行，放置于37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，以蒸餾水代替宣木瓜提取物作為陽(yáng)性對(duì)照。利用游標(biāo)卡尺，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，以直徑表示抑菌圈的大小。

1.3.5 宣木瓜抑菌活性成分分離

將宣木瓜提取物用蒸餾水充分溶解后，利用有機(jī)溶劑進(jìn)行分層萃取，分別獲得乙酸乙酯層、正丁醇層、三氯甲烷層和水層。各萃取層經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，經(jīng)蒸餾水溶解分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，各萃取層的抑菌濃度均為0.5 g/mL。

1.3.6 宣木瓜飲料制備工藝流程

原料→選擇→清洗→去籽，切片→發(fā)酵→榨汁→離心過(guò)濾→混合→稀釋→灌裝→殺菌→冷卻→檢驗(yàn)→成品

1.3.7 操作要點(diǎn)

1.3.7.1 發(fā)酵

選取果皮青色的新鮮宣木瓜，將新鮮的宣木瓜清洗切片，按10 g∶1 g取新鮮的宣木瓜和乳酸菌，乳酸菌為保加利亞乳酸菌和嗜熱鏈球菌按質(zhì)量比1∶1混合的混合菌。加入蒸餾水，新鮮宣木瓜：蒸餾水為1 g∶10 g。在溫度30℃～45℃培養(yǎng)24 h～36 h，得到新鮮宣木瓜的浸泡發(fā)酵液和浸泡發(fā)酵祛澀的宣木瓜。

1.3.7.2 調(diào)配

將新鮮宣木瓜的浸泡發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾，得發(fā)酵清液備用。將浸泡發(fā)酵祛澀的宣木瓜上清液在高速離心機(jī)以 3 000 r/min，離心 3 min，使用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，得上清液。按體積比2 mL∶3 mL將發(fā)酵清液和上清液混合，得到高濃度混合果汁，按體積比1 mL∶2 mL在高濃度混合果汁中加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，得到口感適宜的宣木瓜功能飲品。調(diào)配優(yōu)化方法參考相關(guān)專利[19]：一種抗氧化宣木瓜功能飲品（申請(qǐng)?zhí)枺?01710863172.5）

1.3.7.3 均質(zhì)殺菌

將調(diào)配好的復(fù)配飲品進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)前進(jìn)行預(yù)熱，達(dá)到60℃～65℃，均質(zhì)壓力為10 MPa～20 MPa。將得到的宣木瓜低澀飲料在殺菌鍋中110℃殺菌30 min。

1.4 宣木瓜飲料指標(biāo)測(cè)定

為了進(jìn)一步明確宣木瓜低澀飲料內(nèi)有效活性成分的穩(wěn)定性，試驗(yàn)設(shè)置冷藏的3個(gè)不同階段[新鮮飲料（A），冷藏 40 d后（B），冷藏 90 d后（C）]，對(duì)飲料內(nèi)部的有效成分（多糖、三萜、黃酮、多酚、抗氧化活性）進(jìn)行測(cè)定。理化指標(biāo)：采用pH計(jì)測(cè)定酸度。微生物指標(biāo)：按GB 4789.10-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》、GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》、GB4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》規(guī)定的方法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)單位為CFU/mL。

1.4.1 多糖的測(cè)定

用苯酚-硫酸方法測(cè)定宣木瓜提取物中的多糖含量。稱取于105℃烘干至恒重的葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶定容，配成濃度為0.04 mg/mL葡萄糖母液。取0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2.0 mL 于試管中加蒸餾水至2.0 mL，加入1 mL 6%苯酚，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，沸水浴中加熱30 min，迅速冷卻至室溫25℃，于490 nm處測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0.05 mL飲料于試管中加蒸餾水至2 mL，加入1 mL 6%苯酚，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，沸水浴中加熱30 min，迅速冷卻至室溫25℃，于490 nm處測(cè)吸光值，檢測(cè)宣木瓜中多糖含量，并以葡萄糖當(dāng)量進(jìn)行表示[mg葡萄糖當(dāng)量（G）/mL飲料]。

1.4.2 三萜的測(cè)定

采用香草醛-冰醋酸方法測(cè)定宣木瓜提取物中的三萜類化合物含量。精確稱取于80℃烘干至恒重的熊果酸4.6 mg于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容。取0.0、0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 標(biāo)準(zhǔn)熊果酸溶液，于 80 ℃水浴鍋中揮發(fā)乙酸乙酯。加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，于65℃恒溫水浴鍋中加熱20 min后，于冰水中靜置5 min。樣品于532 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取宣木瓜飲料1 mL，于80℃水浴鍋中揮發(fā)溶液，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，于65℃恒溫水浴鍋中加熱20 min后，于冰水中靜置5 min。樣品于532 nm處測(cè)定吸光值。檢測(cè)宣木瓜中三萜含量，并以熊果酸含量的方式進(jìn)行表示，（mg熊果酸當(dāng)量（U）/mL飲料）。

1.4.3 總酚的測(cè)定

利用福林酚法采用兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定飲料中的總酚含量，試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[20]。取稀釋相應(yīng)倍數(shù)的樣品10μL樣品置于96平板中，并依次加入70 μL水和20 μL福林酚試劑（2N）置于暗處反應(yīng)5 min，加入20%碳酸鈉100 μL后置于暗處反應(yīng)30 min。利用酶標(biāo)儀測(cè)定混合物在730 nm處的吸光值。兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品用來(lái)測(cè)定提取液中的總酚含量。最終結(jié)果表示為每毫升飲料中含有兒茶素（E）當(dāng)量（mg）的總酚。

1.4.4 黃酮的測(cè)定

利用AlCl3·6H2O法測(cè)定飲料中的黃酮含量[21]。取20 μL 飲料，加入 90 μL 乙醇后加入 100 μL 2%AlCl3·6H2O，置于暗處反應(yīng)5 min，于430 nm測(cè)定讀數(shù)。利用槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)品，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。飲料中的黃酮含量以槲皮素當(dāng)量表示mg槲皮素（Q）/mL飲料。

1.4.5 抗氧化性的測(cè)定

采用測(cè)定飲料的抗氧化活性，試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[21]。采用ABTS法（取宣木瓜提取物液稀釋5倍后，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確稱取33 mg ABTS和28.4 mg過(guò)硫酸鉀于100 mL水中充分溶解，置于暗處16 h后使用。取不同體積（10 μL～50 μL）的宣木瓜提取液稀釋至100 μL，與100 μL ABTS置于暗處混合5 min后，用酶標(biāo)儀于734 nm處讀數(shù)，計(jì)算宣木瓜提取液清除ABTS自由基的IC50，以維生素C為標(biāo)準(zhǔn)品，并測(cè)定其IC50）當(dāng)自由基清除率為50%時(shí)，每100 mL宣木瓜飲料中含有抗氧化活性物質(zhì)的維生素C當(dāng)量（mg VC/100 mL飲料）。

利用經(jīng)過(guò)修改的DPPH分析方法分析飲料的抗氧化活性，并以VC作為標(biāo)準(zhǔn)品。利用乙醇作為溶劑準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品VC儲(chǔ)備液（1 mg/mL）。利用乙醇稀釋DPPH試劑準(zhǔn)備DPPH工作液（0.15 mg/mL）。在分析之前，飲料用乙醇稀釋2倍，取5 μL提取物加于96平板中，加入95 μL乙醇后加入100 μL DPPH溶液，將上樣后的96平板在溫室25℃條件下置于黑暗處?kù)o置30 min，所有樣品均以乙醇作為空白，利用酶標(biāo)儀與波長(zhǎng)515 nm處讀取各樣品的吸收波長(zhǎng)，所有樣品以乙醇作為參考對(duì)照。結(jié)果表示為：當(dāng)對(duì)DPPH自由基清除能力為50%時(shí)，每100 mL飲料中含有的抗氧化物質(zhì)含量的VC當(dāng)量（mg VC/100 mL飲料）。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣木瓜抑菌活性

當(dāng)宣木瓜粗提物濃度為0.5 g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小分別為18、22、20 mm，抑菌效果較好。為進(jìn)一步明確宣木瓜抑菌活性成分的分布，粗提物的水溶液分別經(jīng)正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取物進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后，測(cè)定抑菌活性見(jiàn)表1。

由表1可知，各層均有抑菌活性，且乙酸乙酯層抑菌效果最佳，試驗(yàn)結(jié)果表明宣木瓜粗提物中具有抑菌活性的有效成分較多，且處于不同極性范圍。宣木瓜中的熊果酸和齊墩果酸均具有較強(qiáng)的抑菌活性，且經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后，熊果酸和齊墩果酸主要富集在乙酸乙酯層，本試驗(yàn)中乙酸乙酯層具有最強(qiáng)的抑菌活性，可能與熊果酸和齊墩果酸有關(guān)[22-23]。然而，各萃取層的具體抑菌活性成分需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 宣木瓜提取物各萃取層的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of different extract layers of Xuan Mugua

2.2 產(chǎn)品質(zhì)量與衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

本飲料采用專利：一種抗氧化宣木瓜功能飲品（申請(qǐng)?zhí)枺?01710863172.5）中的優(yōu)化方法獲得，飲料成品呈現(xiàn)乳白色，口感微酸，具有淡淡的清香，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的宣木瓜中單寧含量降低了78%，有效降低了飲料成品的澀感[24]。飲料的酸度隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，90 d后pH值由3.3升至3.2，口感變化不大。每升飲料中含有的多酚類化合物相當(dāng)于兒茶素1.08 g，利用ABTS/DPPH方法測(cè)定宣木瓜飲料的抗氧化活性，當(dāng)自由基清除率為50%時(shí)，每升飲料中含有的抗氧化物質(zhì)分別相當(dāng)于VC0.57 g和0.34 g[19]。飲料中大腸菌群、菌落總數(shù)＜1 CFU/mL，致病菌未檢出，符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 宣木瓜飲料在冷藏過(guò)程中各指標(biāo)的測(cè)定

宣木瓜果實(shí)中含有豐富的多糖，三萜及酚類化合物，為了明確宣木瓜飲料在保藏過(guò)程中內(nèi)部活性成分的變化，本試驗(yàn)檢測(cè)了在不同保存期內(nèi)飲料內(nèi)部活性成分的變化見(jiàn)表2。

由表2可知，飲料中的多糖含量在90 d內(nèi)的冷藏期內(nèi)由初始的0.735 mg葡萄糖/mL降低至0.703 mg葡萄糖/mL飲料，三萜類化合物的含量呈現(xiàn)先上升（由0.245 mg熊果酸/mL上升至0.401 mg熊果酸/mL飲料）后下降（0.322 mg熊果酸/mL飲料）的趨勢(shì)，總酚類化合物則在保藏期間持續(xù)下降（由1.269 mg兒茶素/mL降至1.101 mg兒茶素/mL飲料），黃酮類化合物出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。飲料內(nèi)部活性成分發(fā)生波動(dòng)性變化，可能是由于飲料在冷藏過(guò)程中酸度的變化導(dǎo)致多糖、三萜、多酚和黃酮類化合物的溶解性發(fā)生變化。利用ABTS和DPPH測(cè)定飲料的抗氧化活性，則發(fā)現(xiàn)DPPH方法測(cè)得的活性逐漸減小（由10.47 mg VC/100 mL飲料降至6.30 mg VC/100 mL），而ABTS方法則是先下降后上升的趨勢(shì)（由7.55 mg VC/100 mL上升至10.09 mg VC/100 mL），ABTS抗氧化活性增強(qiáng)，可能與飲料中三萜，總酚及黃酮總含量的升高有關(guān)。兩種方法出現(xiàn)的結(jié)果不同，可能是由于二者使用的溶劑載體不同，ABTS方法內(nèi)主要是水溶性化合物的抗氧化活性，而DPPH方法則是醇溶性化合物起主要作用。

表2 宣木瓜飲料內(nèi)部活性成分在冷藏期間的變化Table 2 Change of active ingredients in the beverage during refrigeration

3 結(jié)論

宣木瓜作為安徽省宣城市藥食同源的道地藥材，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。本研究發(fā)現(xiàn)宣木瓜提取物具有較好的抑菌效果，以宣木瓜為原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵，調(diào)配，滅菌等一系列工藝制作的飲料在保藏期間的內(nèi)部活性成分三萜和黃酮含量在冷藏90 d后，含量分別上升了31%和2%，多糖和總酚含量則出現(xiàn)下降，分別下降了5%和14%。酸度變化不大。雖然飲料在儲(chǔ)藏過(guò)程中抗氧化活性程度出現(xiàn)波動(dòng)，但總體仍保持較好的抗氧化活性。本研究為提升宣木瓜精深加工技術(shù)水平和綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值奠定了重要基礎(chǔ)。