PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測中的運用研究

苗輝 林靜

隨著收入水平的提高，老百姓對食品的消費能力越來越強，為適應(yīng)人們的消費需求，市場上的食品類型也日益多樣化和個性化。在這一形勢下，食品質(zhì)量安全檢測工作十分重要。近年來，食品安全檢測技術(shù)手段不斷涌現(xiàn)，給食品安全檢測工作提供了更多選擇。其中PCR技術(shù)因其準(zhǔn)確性和高效性在眾多技術(shù)手段中脫穎而出，成為越來越多食品檢測機構(gòu)和部門采用的一種技術(shù)方法。

PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測中的作用

PCR技術(shù)是一種基因技術(shù)全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，該技術(shù)通過體外模擬DNA的復(fù)制過程來獲得目標(biāo)DNA片段，從而對實驗對象的基因特征進行分析和判定。在食品微生物檢測工作中，利用PCR技術(shù)能夠?qū)κ称窓z測樣品中的微生物，哪怕是含量很少的微生物進行基因標(biāo)記及基因復(fù)制，可以在很短的時間內(nèi)檢測較多的食品樣品，而且檢測自動化程度高，操作簡便，因此該方法在食品微生物檢測中的運用效率很高。

PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用方法

PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用十分廣泛，比如對金黃色葡萄球菌的檢測、對綠膿桿菌的檢測、對大腸桿菌的檢測、對沙門氏菌的檢測等等，均表現(xiàn)出較好的檢測效果。金黃色葡萄球菌容易在蔬菜、瓜果等食品中生存繁殖，代謝產(chǎn)物中存在SE類型的有害物質(zhì)，這種物質(zhì)對食用者極可能造成食物中毒，PCR技術(shù)可以對食品樣品中的SE物質(zhì)進行微量檢測，可精確到1pg。綠膿桿菌代謝產(chǎn)物中含有毒素的特定基因可以被PCR技術(shù)中的特定蛋白有效標(biāo)記，通過特定蛋白的檢測間接獲得綠膿桿菌的含量。采用同樣的原理，PCR技術(shù)可以對食品中的大腸桿菌、沙門氏菌進行特定基因擴增、標(biāo)記，準(zhǔn)確高效地得到這些微生物在食品樣品中的含量。

在實際應(yīng)用中，PCR技術(shù)又可以分為以下幾種測定方法。

常規(guī)PCR檢測法：測定目標(biāo)物質(zhì)的DNA模板和與之相對應(yīng)的引物進行混合，然后向混合物中加入一定量的聚合酶。在特定的溫度和催化劑條件狹隘，聚合酶會促使目標(biāo)物質(zhì)的DNA模板序列擴增，經(jīng)歷DNA復(fù)制的多個周期后便得到DNA片段。這一DNA片段可以作為循環(huán)DNA模板繼續(xù)進行復(fù)制擴增。在放大目標(biāo)物質(zhì)后，對待測目標(biāo)物質(zhì)特定DNA進行標(biāo)記測定，間接得到待測物的微生物含量。

多重PCR檢測法：該方法的原理是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上采用多個DNA引物，比如在同一個PCR反應(yīng)體系里引入兩個或兩個以上的反應(yīng)引物，在聚合酶的作用下，這些引物同時發(fā)生復(fù)制擴增，繼而得到多個DNA片段。與常規(guī)PCR檢測法不同的是，多重PCR檢測法可以微生物的多個致病因子進行檢測，而常規(guī)PCR檢測法用于微生物單一致病因子的測定。該方法除了具有常規(guī)PCR檢測法的高效性和準(zhǔn)確性以外，還具有良好的系統(tǒng)性，能夠?qū)Τ山M的微生物病原體或致病基因進行檢測，因此是一種經(jīng)濟高效的食品微生物檢測方法。

PR-PCR檢測法：此種檢測方法是PCR檢測法的變形，其技術(shù)原理是將檢測目標(biāo)中的一條RNA先進行逆轉(zhuǎn)錄得到與之互補的DNA，然后以得到的DNA鏈為模板再通過常規(guī)PCA技術(shù)進行DNA的復(fù)制擴增。此種檢測方法的技術(shù)關(guān)鍵在于RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，必須確保RNA模板為完整的而且不含有蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)的基因鏈。PR-PCR檢測法可以作為微生物檢測的定性分析，還可以用于微生物檢測的定量分析，比如將熒光技術(shù)和數(shù)字技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，可以對檢測目標(biāo)中的微生物進行定量，檢測具有較好的靈敏性，檢測結(jié)果更加精確。

上圖為常見的食品微生物PCR檢測方法的病毒基因圖。圖中，M列代表1000 bp DNA Marker；1列代表鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄糖球菌；2列代表鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7；3列代表鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞性李斯特菌；4列代表金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7；5列代表金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌；6列代表大腸桿菌O157：H7、大腸桿菌O157：H7；8列代表鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌；9列代表金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、單核細胞性李斯特菌；10列代表鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核細胞性李斯特菌；11列代表鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、單核細胞性李斯特菌；12列代表ddH2O。

PCR技術(shù)的發(fā)展方向

PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用越來越普遍，并發(fā)揮出越來越不容忽視的作用。未來，PCR技術(shù)的發(fā)展重點集中在三個方面。一方面，DNA或RNA模板的純度要求越來越高。PCR技術(shù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性在很大程度上取決于DNA或RNA模板的純度，因此未來的研究工作會集中在DNA或RNA的提取方法研究上，以獲得更高的提取效率和提取純度。另一方面，PCR檢測實驗中出現(xiàn)的假陽性問題將進一步攻克。由于食品中的微生物種類多而且具有不穩(wěn)定性，因此在PCR檢測過程中會因為PCR技術(shù)方法的高靈敏度而出現(xiàn)一定的假陽性現(xiàn)象，在如何識別假陽性，如何避免假陽性問題上，未來將會有更多的方法，進一步提高PCR技術(shù)監(jiān)測的準(zhǔn)確性。第三方面，隨著數(shù)據(jù)時代的到來，數(shù)據(jù)技術(shù)與PCR技術(shù)的結(jié)合也將更加緊密，演變?yōu)閿?shù)字PCR技術(shù)。近幾年，國內(nèi)的數(shù)字PCR開發(fā)商已經(jīng)有十幾家，數(shù)字PCR技術(shù)的關(guān)鍵越來越側(cè)重于芯片設(shè)計和制作，通過內(nèi)置芯片實現(xiàn)微滴式可智能識別的質(zhì)量控制目標(biāo)，將自動化和智能化以數(shù)據(jù)的形勢表達和呈現(xiàn)。芯片式數(shù)字PCR技術(shù)可以將微滴液體隨機排布與芯片的陣列結(jié)構(gòu)中，對于改善傳統(tǒng)PCR技術(shù)中的熱擴散造成的檢測結(jié)果偏差十分有效。數(shù)字PCR技術(shù)突破了傳統(tǒng)技術(shù)中檢測結(jié)果受到標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的限制，而且在高背景下也可以獲得精準(zhǔn)的檢測結(jié)果，使基因定量檢測結(jié)果的靈敏性和特異性大大提高，未來，數(shù)字PCR技術(shù)在食品微生物檢測中應(yīng)用前景良好。

食品的安全監(jiān)管和食品質(zhì)量問題是國家和社會民眾十分關(guān)注的問題。近年來，食品市場中的質(zhì)量問題事件仍有發(fā)生，不僅破壞了市場的健康有序發(fā)展，而且給消費者帶來了更多的不確定和不信任因素，影響到社會穩(wěn)定和諧。食品檢驗檢測工作容不得絲毫懈怠。在食品微生物檢測中，PCR技術(shù)憑借高靈敏度和高準(zhǔn)確度從眾多的檢測技術(shù)中脫穎而出。未來，食品檢測部門及從業(yè)人員應(yīng)繼續(xù)圍繞實際，加大探索力度，推動該技術(shù)應(yīng)用水平的不斷提升，為食品安全監(jiān)管工作提供強大的技術(shù)支持。