畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程的染菌分析及預(yù)防策略

曹家明 許超群 曾憲放

摘要：針對(duì)畢赤酵母（Pichia pastoris）在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的染菌現(xiàn)象，按照質(zhì)量控制要素及工藝流程進(jìn)行全面分析。通過(guò)對(duì)工作種子庫(kù)、一級(jí)種子、二級(jí)種子、濾芯、發(fā)酵罐及發(fā)酵菌體進(jìn)行系統(tǒng)排查發(fā)現(xiàn)，染菌是由賽多利斯取樣閥密封圈磨損及試驗(yàn)人員的不規(guī)范操作造成的。因而在試驗(yàn)操作、設(shè)備維護(hù)、車(chē)間管理、文件修訂、人員培訓(xùn)等方面實(shí)施一系列糾正預(yù)防措施，隨后進(jìn)行多批次的發(fā)酵生產(chǎn)。結(jié)果表明，試驗(yàn)結(jié)果與歷史數(shù)據(jù)具有高度的一致性，從而避免了染菌現(xiàn)象的再次發(fā)生。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母;發(fā)酵;染菌分析;預(yù)防策略

中圖分類(lèi)號(hào)： S182?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）08-0265-07

收稿日期：2019-03-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2015ZX09101035、2017ZX09308003）;上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”生物醫(yī)藥領(lǐng)域科技支撐項(xiàng)目（編號(hào)：18431905600）;上海市科技人才計(jì)劃（編號(hào)：16QB1404200）。

作者簡(jiǎn)介：曹家明（1985—），男，江蘇常州人，碩士，工程師，主要從事生物藥物開(kāi)發(fā)、基因工程菌發(fā)酵、蛋白藥物純化等方面的研究。E-mail：caojiaming@walvax.com。

自從Cregg等于1985年利用重組畢赤酵母（Pichia pastoris）成功表達(dá)外源蛋白[1]以來(lái)，畢赤酵母因高效表達(dá)外源蛋白、操作簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而受到科學(xué)家和工業(yè)界的青睞，目前已有超過(guò)500個(gè)蛋白在畢赤酵母中表達(dá)成功，表達(dá)產(chǎn)物包括干擾素、酶制劑、抗體等[2-4]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，簡(jiǎn)稱(chēng)FDA）認(rèn)定畢赤酵母是一般公認(rèn)安全的（generally regarded as safe，簡(jiǎn)稱(chēng)GRAS）微生物，為其在醫(yī)藥和食品中的應(yīng)用鋪平了道路[5]。目前，人們已經(jīng)在該系統(tǒng)中成功表達(dá)了胰島素、彈性蛋白酶、S-腺苷基甲硫氨酸、干擾素、白細(xì)胞介素、溶菌酶等多種治療性藥物[6-7]。隨著畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究的不斷推進(jìn)，會(huì)有更多外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)，從而在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

隨著發(fā)酵技術(shù)、生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)制造的發(fā)展更新，生產(chǎn)過(guò)程中的染菌率已經(jīng)明顯下降，然而染菌仍是發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的最大“敵人”，染菌輕者會(huì)降低產(chǎn)品的產(chǎn)率及質(zhì)量，嚴(yán)重者會(huì)造成發(fā)酵失敗，不僅會(huì)增加發(fā)酵的生產(chǎn)成本，打亂生產(chǎn)計(jì)劃，還會(huì)造成環(huán)境污染[8-9]。宋磊等從染菌時(shí)間、類(lèi)型、范圍3個(gè)方面探討透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌的原因，提出防止發(fā)酵染菌及染菌后的補(bǔ)救措施[10]。任石茍等對(duì)乳酸生產(chǎn)過(guò)程中的染菌原因進(jìn)行分析，提出了預(yù)防和治理措施[11]。李素榮等通過(guò)加強(qiáng)菌種、無(wú)菌用具、環(huán)境、人員培訓(xùn)等的管理，使染菌率由9.64%降至1.20%[12]。丁瑋云等介紹了賴(lài)氨酸發(fā)酵染菌的危害性及由設(shè)備引起的染菌原因，并提出防控措施[13]。劉利通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)跟蹤調(diào)查，得出設(shè)備、空氣和員工操作失誤引起的染菌概率最大，應(yīng)該從這3個(gè)方面入手減少染菌[14]。目前的染菌研究多集中于抗生素、谷氨酸等傳統(tǒng)產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中的染菌途徑、不同發(fā)酵階段染菌對(duì)發(fā)酵的影響及防治措施等方面[9，15-16]，鮮有針對(duì)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufacturing practices，簡(jiǎn)稱(chēng)GMP）環(huán)境下發(fā)酵生產(chǎn)中染菌排查的報(bào)道[17]。本研究以筆者所在公司車(chē)間在進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)外源蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的1例染菌現(xiàn)象為列，對(duì)可能的染菌過(guò)程進(jìn)行分析、排查，并采取相應(yīng)的預(yù)防和整改措施，以期為醫(yī)藥企業(yè)在重組菌發(fā)酵生產(chǎn)中出現(xiàn)染菌現(xiàn)象時(shí)進(jìn)行快速排查及預(yù)防提供一些思路。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)試劑

酵母粉，購(gòu)自O(shè)XOID公司;蛋白胨，購(gòu)自日本制藥株式會(huì)社;甘油，購(gòu)自湖南爾康制藥股份有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 （tryptone soy agar，簡(jiǎn)稱(chēng)TSA培養(yǎng)基）平板，購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司。

1.2?酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，簡(jiǎn)稱(chēng)YPG培養(yǎng)基）

YPG培養(yǎng)基配方如下：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉、20 g/L甘油。用2 L錐形瓶分裝1 L培養(yǎng)基，在30 L發(fā)酵罐中裝入8 L培養(yǎng)基，在210 L發(fā)酵罐中裝入120 L培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌20 min。

1.3?儀器與設(shè)備

NLF22 30 L發(fā)酵罐，購(gòu)自瑞士比歐生物工程公司;BIOSTATC-plus 30 L發(fā)酵罐，購(gòu)自賽多利斯公司;P 210 L發(fā)酵罐，購(gòu)自瑞士比歐生物工程公司;立式壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;全溫振蕩培養(yǎng)箱，購(gòu)自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;顯微鏡，購(gòu)自重慶光學(xué)儀器廠。

1.4?試驗(yàn)方法

（1）人員操作排查。相應(yīng)批次的試驗(yàn)人員回顧相關(guān)操作，分析可能的風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)。（2）工作種子庫(kù)排查。領(lǐng)取1支工作種子，吸取100 μL，稀釋一定倍數(shù)后涂布TSA平板，培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)，并挑取單菌落進(jìn)行鏡檢。（3）一級(jí)種子排查。領(lǐng)取1支工作種子，接種于YPG培養(yǎng)基中，于 30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，取1 mL發(fā)酵液稀釋至一定倍數(shù)后涂布平板，培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)，并挑取單菌落進(jìn)行鏡檢。（4）濾芯檢查。拆下壓縮空氣管路及發(fā)酵罐上的濾芯，檢查外觀，并進(jìn)行完整性測(cè)試。（5）空培試驗(yàn)。30L發(fā)酵罐設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min、培養(yǎng)溫度30 ℃、通氣量 10 L/min，不進(jìn)行接種，空培72 h后，觀察是否有雜菌生長(zhǎng)現(xiàn)象。210 L發(fā)酵罐設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速 300 r/min、培養(yǎng)溫度30 ℃、通氣量100 L/min，不進(jìn)行接種，觀察是否有雜菌生長(zhǎng)現(xiàn)象;空培48 h后，若210 L發(fā)酵罐未染菌，則進(jìn)行甘油、甲醇補(bǔ)料操作，觀察是否有雜菌生長(zhǎng)現(xiàn)象;空培72 h后，若210 L發(fā)酵罐未染菌，則模擬移種操作，將30L發(fā)酵罐中未染菌的培養(yǎng)基按正常移種操作移入210 L發(fā)酵罐中繼續(xù)空培48 h，觀察是否有雜菌生長(zhǎng)現(xiàn)象。（6）接種培養(yǎng)。對(duì)空培正常的30 L發(fā)酵罐進(jìn)行接種，按照“（5）空培試驗(yàn)”中的培養(yǎng)條件進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后無(wú)菌取樣鏡檢，涂布平板培養(yǎng)，檢查是否有染菌。（7）菌體檢查。在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌刮取最近批次的發(fā)酵菌體，適當(dāng)稀釋后涂布于平板上，37 ℃ 培養(yǎng)2～3d，觀察是否有雜菌生長(zhǎng)。（8）染菌判斷。在培養(yǎng)過(guò)程中觀察pH值是否有明顯變化（波動(dòng)大于1表示變化明顯），溶氧量（由發(fā)酵罐自帶電極測(cè)量）有無(wú)明顯下降（波動(dòng)大于20%表示變化明顯），發(fā)酵液顏色是否澄清，是否有異常氣味，鏡檢觀察是否有雜菌等，若有其中1項(xiàng)發(fā)生明顯變化，則認(rèn)為發(fā)生染菌。

2.2.8?染菌調(diào)查試驗(yàn)小結(jié)

（1）經(jīng)過(guò)試驗(yàn)人員的回憶與分析，存在一些不規(guī)范操作;（2）NLF22 30L發(fā)酵罐在進(jìn)行空培、取樣操作、接種操作、二級(jí)種子培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)取樣鏡檢并稀釋涂平板，未發(fā)現(xiàn)有染菌現(xiàn)象;（3）C-plus 30 L發(fā)酵罐在空培過(guò)程中發(fā)生染菌，經(jīng)過(guò)對(duì)取樣閥進(jìn)行嚴(yán)格處理和更換密封圈后進(jìn)行空培及二級(jí)種子培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)染菌現(xiàn)象;（4）P 210 L發(fā)酵罐進(jìn)行了空培、取樣、移種、補(bǔ)料等操作，共進(jìn)行160h的試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)有染菌現(xiàn)象;（5）不同發(fā)酵罐最近發(fā)酵的菌體均未出現(xiàn)染菌;（6）分析染菌原因，可能是存在不規(guī)范的試驗(yàn)操作現(xiàn)象。C-plus 30 L發(fā)酵罐取樣閥的設(shè)計(jì)造成密封圈極易磨損。

2.3?預(yù)防及糾正措施

筆者所在公司的車(chē)間環(huán)境為GMP條件，發(fā)酵罐均為進(jìn)口的全自動(dòng)發(fā)酵系統(tǒng)，且發(fā)酵規(guī)模遠(yuǎn)小于大宗產(chǎn)品，因此環(huán)境和設(shè)備所帶來(lái)的影響較小。然而，由于在研發(fā)階段一些操作未被寫(xiě)入相關(guān)文件中，并且一些員工入職時(shí)間短，因此筆者從生產(chǎn)流程和人員入手，對(duì)可能造成染菌的環(huán)節(jié)采取預(yù)防及糾正措施，并以文件的形式固定下來(lái)，并對(duì)相關(guān)人員進(jìn)行了系統(tǒng)培訓(xùn)，具體措施如下。

2.3.1?溶液滅菌

2.3.1.1?搖瓶溶液的滅菌?（1）搖瓶溶液滅菌結(jié)束后應(yīng)讓滅菌鍋?zhàn)匀唤禍刂?00 ℃以下，使壓力降至0 MPa，嚴(yán)禁直接手動(dòng)卸壓，否則會(huì)因壓力下降過(guò)快造成封口膜鼓脹甚至松脫。（2）搖瓶溶液在用滅菌鍋滅菌后應(yīng)及時(shí)開(kāi)蓋并取出，放置于桌面或超凈臺(tái)內(nèi)自然冷卻，用75%乙醇表面消毒后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，不得放在水池內(nèi)用純化水冷卻。

2.3.1.2?補(bǔ)料溶液的滅菌?（1）滅菌前應(yīng)將補(bǔ)料軟管插針套筒前端旋開(kāi)，并檢查內(nèi)部棉塞的狀態(tài)，如果有變色或異味應(yīng)立即更換。插針套筒頂端應(yīng)避免靠近滅菌鍋底部，防止滅菌過(guò)程中混入不潔凈的水。（2）檢查補(bǔ)料瓶呼吸過(guò)濾器的狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)破損、變形、進(jìn)水、變色，應(yīng)立即更換。在呼吸過(guò)濾器上標(biāo)明開(kāi)始使用的日期，并在每次滅菌前標(biāo)記滅菌的次數(shù)，重復(fù)滅菌滿(mǎn)20次后立即更換。（3）與四閥組對(duì)接的隔膜閥在滅菌時(shí)應(yīng)使其處于開(kāi)啟狀態(tài)，滅菌結(jié)束取出補(bǔ)料瓶時(shí)應(yīng)旋緊隔膜閥。（4）溶液在滅菌前需要確認(rèn)呼吸器正常、軟管已被止血鉗夾緊。

2.3.2?搖瓶接種?（1）接種前開(kāi)啟紫外燈照射搖瓶溶液的時(shí)間不少于30 min。（2）搖瓶用75%乙醇噴灑消毒后放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，開(kāi)啟風(fēng)機(jī)吹干搖瓶外壁。（3）用帶濾芯的吸頭進(jìn)行接種。

2.3.3?將種子液轉(zhuǎn)移至接種瓶中?搖瓶揭開(kāi)封口膜后，將瓶口立即靠近乙醇燈火焰并旋轉(zhuǎn)瓶身，對(duì)瓶口進(jìn)行烘烤。倒種子液時(shí)，接種瓶不應(yīng)放在雙人超凈工作臺(tái)的中間位置。

2.3.4?發(fā)酵準(zhǔn)備工作?（1）發(fā)酵罐檢漏。發(fā)酵罐定期做保壓測(cè)試，對(duì)于發(fā)現(xiàn)泄漏的地方應(yīng)采取措施解決。（2）30 L發(fā)酵罐的清洗。發(fā)酵罐的清洗要全面，將30 L發(fā)酵罐的可拆卸零部件浸泡于堿液中，包括墊圈、電極堵頭、空氣過(guò)濾器外殼等。30 L發(fā)酵罐的清洗過(guò)程包括3步：（1）用純化水清洗干凈;（2）用0.25 mol/L堿液浸泡2 h以上;（3）用純化水沖洗干凈。用堿液浸泡時(shí)，需要打開(kāi)發(fā)酵罐底閥和取樣閥，確認(rèn)堿液與閥芯充分接觸進(jìn)行浸泡，在取樣閥與底閥出口處連接軟管并用止血鉗夾緊。

2.3.5?30 L發(fā)酵罐的滅菌?在對(duì)30 L發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌的過(guò)程中，對(duì)取樣閥和底閥進(jìn)行同步滅菌。

2.3.6?30 L發(fā)酵罐種子的培養(yǎng)?在30 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)調(diào)節(jié)尾氣閥門(mén)，使罐壓維持在 20 kPa。

2.3.7?30～210 L發(fā)酵罐的移種?（1）對(duì)移種管路滅菌30 min，在滅菌過(guò)程中注意觀察接頭部分是否有蒸汽泄露。（2）將移種管路接頭部分的墊圈浸泡于堿液中，使用前清洗干凈，如有變形或破損，應(yīng)立即更換。（3）在移種過(guò)程中，保持30 L發(fā)酵罐的進(jìn)氣和排氣處于通路狀態(tài)，并調(diào)節(jié)尾氣閥，維持罐壓在50 kPa左右。

2.3.8?過(guò)程取樣?（1）取樣前后都需要對(duì)取樣管路進(jìn)行蒸汽滅菌，時(shí)間設(shè)為5～6 min。滅菌時(shí)遵循蒸汽流動(dòng)方向依次打開(kāi)取樣管路上的隔膜閥，滅菌結(jié)束后則倒序關(guān)閉隔膜閥。（2）210 L發(fā)酵罐取樣時(shí)先打開(kāi)隔膜閥，后打開(kāi)取樣閥。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔24 h通過(guò)取樣鏡檢及平板涂布來(lái)判斷是否染菌。

2.3.9?210 L發(fā)酵罐滅菌?在滅菌過(guò)程中注意觀察閥組、堵頭部分是否有泄露;滅菌完成并冷卻至設(shè)定溫度進(jìn)入保壓模式后，注意觀察罐壓的變化。

2.3.10?210 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程的補(bǔ)料?（1）四閥組補(bǔ)料口對(duì)接后滅菌30 min。（2）開(kāi)啟補(bǔ)料閥組時(shí)，注意開(kāi)啟對(duì)應(yīng)的四閥組，不要錯(cuò)開(kāi)未滅菌的補(bǔ)料四閥組。（3）注意推閥的開(kāi)啟和關(guān)閉狀態(tài)，防止在補(bǔ)料過(guò)程中軟管崩開(kāi)。

2.3.11?維護(hù)保養(yǎng)?（1）30 L發(fā)酵罐進(jìn)氣端濾芯暫定半年更換1次，每批在放罐后拆下并觀察有無(wú)明顯污染、變形或松動(dòng)。（2）210 L發(fā)酵罐進(jìn)氣端空氣過(guò)濾器暫定2批次更換1次，尾氣濾芯每批次更換1次，如需延長(zhǎng)使用次數(shù)，則應(yīng)在使用前進(jìn)行完整性測(cè)試，檢測(cè)合格后方可繼續(xù)使用。（3）每個(gè)批次均對(duì)發(fā)酵罐密封圈進(jìn)行檢查。（4）每個(gè)季度均對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。（5）每個(gè)月均對(duì)超凈工作臺(tái)采用0.2%新潔爾滅/75%乙醇擦拭輪換進(jìn)行消毒;每個(gè)月對(duì)滅菌鍋內(nèi)的水進(jìn)行更換。

2.3.12?GMP管理方面?（1）完善操作人員的交接班記錄。（2）對(duì)相關(guān)人員定期進(jìn)行GMP知識(shí)、車(chē)間管理、發(fā)酵操作等方面的培訓(xùn)。（3）將“2.3.1”節(jié)至“2.3.11”節(jié)中的內(nèi)容整合進(jìn)發(fā)酵罐的操作規(guī)程及工藝規(guī)程中。（4）升級(jí)工藝規(guī)程和發(fā)酵罐SOP。