基于星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化馬齒莧多糖的提取工藝

張志 高暢 付玲玲

摘要：旨在用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧多糖的提取工藝。采用超聲輔助提取法提取馬齒莧多糖，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)提物溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)等單因素結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)法-響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間43 min、料液比1 g ∶23 mL、超聲功率230 W，在該條件下，馬齒莧多糖提取率的預(yù)測(cè)值為6.419%，實(shí)測(cè)平均值為6.524%。由結(jié)果可知，該方法模型的預(yù)測(cè)性良好，提取條件穩(wěn)定，提取過(guò)程簡(jiǎn)便合理、可靠。

關(guān)鍵詞：馬齒莧;多糖;超聲提取;響應(yīng)面-星點(diǎn)設(shè)計(jì);提取率

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）08-0207-06

收稿日期：2019-04-01

基金項(xiàng)目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院青年基金（編號(hào)：吉農(nóng)院合字[2018]第3004號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：張?志（1981—），男，黑龍江哈爾濱人，碩士，講師，主要從事藥物有效成分提取及藥物制劑研究。Tel：（0432）63509964;E-mail：zz004@163.com。

馬齒莧（Portulaca oleracea L.），別稱(chēng)馬莧、五行草、長(zhǎng)命菜等，屬于一年生肉質(zhì)類(lèi)草本植物。《本草綱目》記載“其葉并比如馬齒，而性滑利似莧，故名馬齒莧”[1]。馬齒莧是被世界衛(wèi)生組織提名的最有用處的藥用植物之一，也是藥食同源的野生植物之一[2]。目前，市場(chǎng)上研發(fā)的主要是馬齒莧食用產(chǎn)品，如功能飲料，此外還有含有馬齒莧的化妝品等，而作為藥品使用的馬齒莧的利用率較低。馬齒莧的活性成分主要有多糖、黃酮、有機(jī)酸、生物堿等，目前對(duì)于馬齒莧多糖的研究主要集中在藥理活性方面，對(duì)馬齒莧多糖的相關(guān)研究顯示，其藥理活性主要是降低血糖數(shù)值，也可以降低血脂，同時(shí)具有抗氧化、抗病毒等功效，具備很好的藥用功能[3-6]。近年來(lái)，關(guān)于馬齒莧多糖提取工藝的研究也陸續(xù)有不少報(bào)道，大多數(shù)采用傳統(tǒng)的水提醇沉的提取方法，但是由于水的極性大，容易將馬齒莧中溶于水的其他成分一起浸提出來(lái)，給后續(xù)的分離純化增加了難度[7]。因此，本試驗(yàn)采用星點(diǎn)響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧多糖的超聲提取工藝，以期實(shí)現(xiàn)馬齒莧多糖提取的新突破，從而為后續(xù)馬齒莧多糖的藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)奠定一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

具有根、莖、葉的新鮮馬齒莧全株采摘于花期前，采摘地點(diǎn)為吉林省吉林地區(qū)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院鑒定確認(rèn)。

1.2?試驗(yàn)試劑

D-葡萄糖（分析純），天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;苯酚（分析純），天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;石油醚、丙酮、乙醚（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)制劑有限公司。

1.3?儀器與設(shè)備

KQ-50DA型數(shù)控超聲波提取機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司;725N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司;R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;AUY220電子分析天平，日本島津公司。

1.4?試驗(yàn)方法

1.4.1?馬齒莧多糖的超聲提取及含量檢測(cè)[8]?（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備。采用苯酚-硫酸法，精確稱(chēng)取1 g于105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，以蒸餾水為溶劑，溶解定容于100 mL容量瓶中，搖勻后從中量取1 mL溶液，定容于100 mL容量瓶中并搖勻，即得 0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5個(gè)10 mL容量瓶中，再各加1.0 mL 6%苯酚試劑搖勻，之后迅速加入5 mL濃硫酸溶液，將試管放入沸水中顯色15 min，冷卻至室溫定容。以水為空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程。

（2）馬齒莧的前期處理。將新鮮馬齒莧全株用自來(lái)水沖洗以去除表面雜質(zhì)，將沖洗后的馬齒莧在陰涼干燥處晾至無(wú)水分，放入55 ℃干燥箱中烘干。將干燥后的馬齒莧用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后于密封袋中保存。稱(chēng)取適量馬齒莧干品置于索氏提取器中，用5倍石油醚連續(xù)回流脫脂2次，再用5倍95%乙醇回流提取2次，以除去馬齒莧干品中的單糖、低聚糖、苷類(lèi)等雜質(zhì)，將濾渣于通風(fēng)處晾干。經(jīng)上述處理后，將所得馬齒莧粉末于65 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，用于多糖的提取。

（3）馬齒莧多糖的超聲提取。稱(chēng)取一定量經(jīng)上述方法處理的馬齒莧粉末，放置在100 mL圓底燒瓶中，以水作為提取溶劑，按照不同提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率、料液比進(jìn)行提取，將所得提取液趁熱抽濾，減壓濃縮，離心去除雜質(zhì)，加入無(wú)水乙醇沉淀，靜置24 h后過(guò)濾，用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次，在60 ℃干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，即得馬齒莧多糖粗品。

（4）樣品液中多糖含量的測(cè)定。稱(chēng)取上述試驗(yàn)制得的馬齒莧多糖粗品1 g，用蒸餾水溶解。按照步驟（1）的方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定馬齒莧粗多糖中的多糖含量。測(cè)定樣品吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與回歸方程，計(jì)算樣品中的葡萄糖含量，馬齒莧多糖提取率的計(jì)算公式如下：

馬齒莧多糖提取率=樣品中的多糖含量×粗多糖質(zhì)量/原材料質(zhì)量×100%。

1.4.2?單因素的考察?（1）提取溫度對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5份經(jīng)“1.4.1”節(jié)步驟（2）的方法處理后的馬齒莧干品2 g，置于 100 mL 圓底燒瓶中，按照1 g ∶25 mL的料液比加入蒸餾水，在超聲功率為200 W、提取時(shí)間為 50 min、提取溫度為40、50、60、70、80 ℃的條件下進(jìn)行2次提取試驗(yàn)。所得提取液經(jīng)離心處理后，棄去殘?jiān)⑸锨逡簼饪s醇沉后定容至100 mL容量瓶中，用移液管精確吸取3 mL稀釋液加入比色皿中，再通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定其中的多糖含量。

（2）提取次數(shù)對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響。根據(jù)“1.4.2”節(jié)的試驗(yàn)步驟（1），設(shè)定提取溫度為 60 ℃，進(jìn)行1、2、3、4、5次重復(fù)提取試驗(yàn)，測(cè)定所得提取液中的多糖含量。

（3）提取時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響。參照“1.4.2”節(jié)的試驗(yàn)步驟（1），設(shè)定提取溫度為 60 ℃，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min，進(jìn)行2次提取試驗(yàn)，測(cè)定所得提取液中的多糖含量。

（4）料液比對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響。參照“1.4.2”節(jié)的試驗(yàn)步驟（1），設(shè)定提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為40 min，分別選取料液比為1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL，進(jìn)行2次提取試驗(yàn)，測(cè)定所得提取液中的多糖含量。

（5）超聲功率對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響。參照“1.4.2”節(jié)的試驗(yàn)步驟（1），設(shè)定提取溫度為 60 ℃，提取時(shí)間為40 min，料液比為1 g ∶25 mL，分別選取超聲功率為100、200、300、400、500 W，進(jìn)行2次提取試驗(yàn)，測(cè)定所得提取液中的多糖含量。

1.4.3?響應(yīng)面優(yōu)化?以上述單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取馬齒莧多糖得率（y）為因變量，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）和超聲功率（D）為自變量。采用響應(yīng)面-星點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，選擇的各水平及其對(duì)應(yīng)的編碼值見(jiàn)表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8]

參照“1.4.1”節(jié)的方法，以吸光度（D490 nm）為縱坐標(biāo)、濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如圖1所示，葡萄糖在0.02～0.10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程如下：y=6.695x+0.130 1，r2=0.993 7。

2.2?單因素考察結(jié)果與分析

2.2.1?提取溫度對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響?由圖2可知，馬齒莧多糖提取率隨提取溫度的增大呈逐步上升的趨勢(shì)。在60 ℃時(shí)曲線(xiàn)首次達(dá)到較高點(diǎn)，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，曲線(xiàn)趨于水平，由此可見(jiàn)，當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃后多糖提取率的變化不明顯。

2.2.2?提取次數(shù)對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響?從圖3可以看出，提取次數(shù)對(duì)馬齒莧多糖提取率影響的曲線(xiàn)整體趨于水平，可見(jiàn)提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響不大。提取次數(shù)越多，多糖提取率越高，但是考慮到具體試驗(yàn)操作的可行性和實(shí)際性，將提取次數(shù)定為2次。由于提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響不顯著，不將其列入星點(diǎn)設(shè)計(jì)的考察因素中。

2.2.3?提取時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響?由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值;當(dāng)提取時(shí)間小于40 min時(shí)，曲線(xiàn)呈明顯的上升趨勢(shì)，多糖提取率升高;當(dāng)提取時(shí)間超過(guò) 40 min 時(shí)，曲線(xiàn)呈下降趨勢(shì)，多糖提取率降低。

2.2.4?料液比對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響?由圖5可知，當(dāng)料液比為1 g ∶25mL時(shí)，多糖提取率高于6.0%;當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL時(shí)，雖然多糖提取率隨著料液比的增加而繼續(xù)提高，但多糖提取率的提高幅度逐漸降低;當(dāng)料液比小于1 g ∶25 mL時(shí)，多糖提取率的提高幅度逐漸上升，可見(jiàn)最初的多糖提取率與料液比呈正相關(guān)關(guān)系。

2.2.5 超聲功率對(duì)馬齒莧多糖提取率的影響?由圖6可知，當(dāng)超聲功率為200 W時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值;當(dāng)超聲功率大于200 W時(shí)，曲線(xiàn)開(kāi)始急劇下降，多糖提取率降低，說(shuō)明超聲功率過(guò)大時(shí)，對(duì)多糖提取率有較大影響。

2.3?響應(yīng)面-星點(diǎn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)的記錄與處理

綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以馬齒莧多糖提取率（y）作為響應(yīng)值，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）和超聲功率（D）作為提取因素進(jìn)行多元回歸擬合，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Expert 10軟件對(duì)表2中的一些數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析與擬合，以多糖提取率（y）作為響應(yīng)值，然后對(duì)因素A、B、C、D作多元線(xiàn)性回歸，并利用二項(xiàng)式方程進(jìn)行擬合，模型如下：

Y=6.13+0.22A+0.10B+0.039C+0.34D-0.051AB+0.025AC-0.032AD-0.060BC+0.070BD+0.041CD-0.58A2-0.11B2-0.038C2-0.49D2（R2=0.9142）。

為了檢驗(yàn)二項(xiàng)式擬合方程的有效性，對(duì)所得模型進(jìn)行了方差分析。由表3中的數(shù)據(jù)可以直觀地看出，這個(gè)模型有著極高的顯著性特點(diǎn)（P<0.000 1），從失擬項(xiàng)中可以看出，多糖提取率的F=1.89（P=0.215 2），失擬項(xiàng)不顯著，表明這個(gè)模型對(duì)于多糖提取率的干擾是不顯著的，該回歸方程與實(shí)際的擬合誤差很小，完全能夠用來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，非常適合用于分析馬齒莧超聲提取多糖的流程和工藝優(yōu)化。由P值可以看出，A、B、C、D、AB、AC、A2、B2、C2、D2 這幾個(gè)變量對(duì)于多糖提取率都有不同程度的干擾作用。

2.4?響應(yīng)面參數(shù)優(yōu)化與最佳工藝條件的預(yù)測(cè)

2.4.1?最佳工藝條件的預(yù)測(cè)?根據(jù)上述回歸分析結(jié)果，將多糖提取率與影響因素A、B、C、D及其交互作用擬合為三維曲面圖，以擬合目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因素間的等高線(xiàn)和三維（3D）響應(yīng)圖，以期確定馬齒莧多糖提取的最佳工藝條件。圖7中的顏色變化越快、坡度越大、三維圖的傾斜率越高，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著。在選定的范圍內(nèi)，等高線(xiàn)中最小橢圓中心位置的點(diǎn)，既是極值，也是3D響應(yīng)面的最高點(diǎn)。等高線(xiàn)呈圓形，表示2個(gè)因素的交互作用不明顯，等高線(xiàn)呈橢圓形則相反。對(duì)馬齒莧多糖提取率影響最大的因素是超聲功率，其次是提取溫度和料液比，而提取時(shí)間的影響最小。由圖7還可以看出，除了提取時(shí)間和超聲功率外，各因素間均有比較明顯的交互作用。

2.4.2?最佳提取工藝的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)?通過(guò)Design-Expert 10軟件對(duì)二項(xiàng)式模型進(jìn)行相關(guān)預(yù)測(cè)后，筆者獲取了最佳工藝流程：提取溫度為70℃，時(shí)間為42.7 min， 料液比為1 g ∶23 mL， 超聲功率為230 W，在該條件下，所得多糖提取率為6.524%?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，將提取時(shí)間修正為43 min。為了驗(yàn)證提取工藝的有效性，按照修正后的最佳提取工藝，本研究進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，最后得到多糖提取率均值為6.419%，實(shí)際值對(duì)于預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.61%，說(shuō)明用響應(yīng)曲面法-星點(diǎn)分析得到的理論最佳工藝具有一定的可信度和有效性。

3?結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲技術(shù)提取馬齒莧中的多糖，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過(guò)響應(yīng)曲面法-星點(diǎn)分析多元回歸擬合，對(duì)影響多糖提取率的主要4個(gè)因素（提取溫度、提取時(shí)間、料液比、超聲功率）進(jìn)行考察，建立相互作用的數(shù)學(xué)模型，得到的最終提取工藝條件如下：溫度為70 ℃，時(shí)間為43 min，料液比為 1 g ∶23 mL，超聲功率為230 W，多糖提取率為6.419%。結(jié)果說(shuō)明，基于星點(diǎn)-響應(yīng)面法確定的提取工藝條件相對(duì)于傳統(tǒng)的提取方法可行，多糖提取率有所提高。

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