利用SSR標(biāo)記篩選水稻富γ-氨基丁酸后代材料

王康愷 趙娜 馬嘉欣 王迎超 田玲 楊治偉 洪緣緣 田蕾 張銀霞 楊淑琴 李培富

摘要：以高粱稻-1和寧農(nóng)黑粳的雜交F2代和F4代為試驗材料，在實驗室前期已獲得的稻米籽粒中控制γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量的3個數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）位點基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記對其進(jìn)行基因型檢測，獲得了不同基因組合類型，在此基礎(chǔ)上利用高效液相色譜法，測定各基因組合類型籽粒中GABA含量，探討GABA含量與其類型間的關(guān)系。結(jié)果表明，在F2代和F4代的所有組合類型中，代表高含量純合基因組合類型（BBA組合）中GABA含量的檢測結(jié)果均值最高，代表低含量純合基因組合類型（AAB組合）中GABA含量的檢測結(jié)果均值最低，其檢測結(jié)果與基因型表現(xiàn)一致。顯著性分析表明，GABA含量與不同基因組合類型之間存在極顯著相關(guān)性。同時還表明，相比F2代，F(xiàn)4代的BBA組合中GABA的平均含量增高，AAB組合中GABA的平均含量降低，且變異程度均有降低，特別是低含量純合基因組合類型材料的符合度從53%上升到75%，其結(jié)果表明，低含量純合基因組合類型材料有趨于穩(wěn)定的趨勢。試驗結(jié)果可應(yīng)用于利用分子標(biāo)記輔助選擇富γ-氨基丁酸雜交后代材料的研究中。

關(guān)鍵詞：水稻;γ-氨基丁酸;高效液相色譜;糙米;籽粒;基因型組合;SSR標(biāo)記

中圖分類號： S511.032文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0078-07

收稿日期：2019-03-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金（項目編號：31360324、31760374、31401361）;寧夏農(nóng)業(yè)育種專項課題（編號：2018NYYZ0302）。

作者簡介：王康愷（1991—），男，陜西華陰人，碩士研究生，主要研究方向為水稻遺傳育種。E-mail：1033678950@qq.com。

通信作者：李培富，博士，教授，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：peifμLi@163.com。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又稱γ-氨酪酸，是一種天然存在的非蛋白組成性氨基酸[1]。γ-氨基丁酸不僅在植物組織中存在，同時也在哺乳動物和人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與人體內(nèi)多項代謝及生理活動，具有降血壓、健腦、活化肝腎及調(diào)節(jié)免疫等功能，被譽(yù)為“大腦的天然鎮(zhèn)靜劑”[2]。為了實現(xiàn)“藥食同源”，調(diào)節(jié)人體生理功能，尤其是對GABA攝入量有特殊要求的人群而言，研究并開發(fā)富含GABA的水稻新品種顯得非常必要。

目前，國內(nèi)外對于γ-氨基丁酸的研究主要集中在其生理功能[3-5]、測定方法[6-7]以及發(fā)芽糙米工藝優(yōu)化[8]等方面，對富含GABA新品種培育的研究相對較少。目前，張標(biāo)金通過測定巨胚稻和常規(guī)稻糙米中的GABA含量發(fā)現(xiàn)，巨胚稻糙米中GABA的平均含量顯著高于常規(guī)稻，并從中篩選出富含GABA的巨胚稻GE091[6];Maeda等以金南風(fēng)（Kinmaze）的巨胚突變體作為雜交親本，培育出了巨胚水稻新品種Haiminori，Haiminori籽粒中的GABA含量比日本晴、越光等普通水稻品種籽粒中的γ-氨基丁酸含量高3～4倍[9];日本利用九州大學(xué)的變異巨胚系統(tǒng)EM40和中國農(nóng)試高產(chǎn)品種明光諾里雜交，選育出富γ-氨基丁酸水稻新品種海米諾里[10]，其胚芽內(nèi)的GABA含量比普通品種高約4倍。

本試驗通過檢測雜交F2代182份材料和雜交F4代109份材料的基因型，將所有材料按基因型組合進(jìn)行分類，利用高效液相色譜法，測定各基因型組合籽粒中γ-氨基丁酸含量，分析不同類型材料γ-氨基丁酸含量與基因型的相關(guān)性，旨在為利用分子標(biāo)記輔助選擇培育富γ-氨基丁酸新品種提供參考。

1?試驗材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試水稻材料

試驗材料由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實驗室提供，包括高粱稻-1和寧農(nóng)黑粳雜交F2，共182份單株材料。試驗材料于2017年10月在海南省三亞育種基地種植，采用播后上水的方式，常規(guī)田間管理方法，成熟時單株收獲。再于2018年5月在寧夏大學(xué)水稻育種基地種植，采用旱育秧方式育苗，單株移栽，田間采用常規(guī)栽培管理方法，成熟后收獲單株材料109份。

1.1.2?試驗用相關(guān)引物

本試驗所用引物來自筆者所在實驗室前期構(gòu)建的簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）引物連鎖遺傳圖譜，以GABA含量為10.47 mg/100 g的高粱稻-1作為父本，以GABA含量為5.57 mg/100 g的寧農(nóng)黑粳作為母本，以雜交F2群體為基礎(chǔ)，篩選出貢獻(xiàn)率最高的3個數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）位點，再對其進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如表1所示，其中qGABA-8-1和qGABA-8-2來自母本寧農(nóng)黑粳，qGABA-9來自父本高粱稻-1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。

1.2?試驗方法

1.2.1?籽粒γ-氨基丁酸含量的測定

本試驗采用水提法（參照程威威等的提取方法[7，11]并進(jìn)行優(yōu)化），提取水稻糙米中的GABA。將收獲的182份雜交F2代和109份雜交F4代籽粒于60 ℃烘箱中烘干備用，使用礱谷機(jī)脫殼，磨粉機(jī)研磨，過80目篩，準(zhǔn)確稱取糙米粉（1.000 0±0000 2） g，每份材料重復(fù)3次，倒入50 mL離心管中，加入15 mL超純水，混勻，60 ℃、120 r/min水浴振蕩浸提90 min，12 000 r/min 離心20 min，將上清液移入圓底燒瓶中，重復(fù)上述操作，將2次上清液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在96 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后濃縮到5 mL，過 0.2 μm 有機(jī)濾膜，得到糙米中γ-氨基丁酸提取液，然后將提取液進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）柱前衍生，使用安捷倫1220高效液相色譜儀進(jìn)行測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算籽粒γ-氨基丁酸含量。

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，以γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出γ-氨基丁酸濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1 133 314x-1 023.11，相關(guān)系數(shù)r2=0997 4。

1.2.2?葉片DNA的提取及檢測

本試驗采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法提取葉片中的DNA，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，配制20 μL反應(yīng)體系，其中10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，2.5 μmol/mL dNTP 0.4 μL，引物（2 mmol/L）15 μL，Taq酶0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個重復(fù);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測，銀染顯色，包膠，并于膠片觀察燈下觀察，讀膠。

1.3?試驗數(shù)據(jù)處理

電泳后，讀取雜交后代群體的條帶，將與寧農(nóng)黑粳帶型一致的條帶記為B，與高粱稻-1帶型一致的條帶記為A，雙親雜合型條帶記為H，缺失記為“-”。在Microsoft Excel表中整理統(tǒng)計4種帶型數(shù)據(jù)，用Microsoft Excel完成試驗數(shù)據(jù)的處理及繪圖，并用SPSS19.0分析軟件進(jìn)行方差分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?雜交后代群體基因型分析

將所用引物合成，按要求稀釋，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，部分結(jié)果如圖2所示，統(tǒng)計全部結(jié)果得出，其中有效條帶占全部條帶的 94.65%，數(shù)據(jù)可靠性較高，可用于下一步檢測分析。

2.2?雜交后代單株籽粒基因型組合及其對應(yīng)γ-氨基丁酸含量

對雜交F2代和F4代材料的單株籽?；蛐瓦M(jìn)行分類，并對其相應(yīng)GABA含量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如表3、表4所示。由表3可以看出，F(xiàn)2群體中，GABA含量最高為 15.02 mg/100 g，其基因組合類型為BBH，最低為377 mg/100 g，其基因組合類型為AAB，其中純合基因型組合材料中GABA含量最高為12.15 mg/100 g，對應(yīng)基因組合類型為BBA;由表4可以看出，F(xiàn)4群體中，GABA含量最高為 12.89 mg/100 g，其基因組合類型為BBB，最低為299 mg/100 g，其基因組合類型為AAB。綜上，在F2、F4代群體中，GABA含量最低的材料基因型組合均為AAB，但最高含量來自不同基因型組合。

2.3?雜交后代籽粒中γ-氨基丁酸含量與其基因組合類型的差異顯著性分析

由圖3可以看出，HHA、BBA基因組合類型的GABA含量高于BBB、HBH、HHH、HAH、HHB、AAA、AAH、HAB、AAB基因組合類型，AAH、HAB、AAB類型含量低于BBH、HHA、BBA類型，且均呈極顯著差異。其中HHA、BBA基因組合類型材料的GABA平均含量較高，分別為10.08、9.87 mg/100 g，AAB基因組合類型材料平均含量最低，為 5.98 mg/100 g，前者分別是后者的1.69、1.65倍。從遺傳學(xué)角度來看，雜合材料存在分離且穩(wěn)定性不高，所以選擇純合BBA類型進(jìn)行后代遺傳。由圖4可以看出，BBA類型GABA含量高于HHB、BBH、AHB、HHH、HBB、HAB、AAB類型，AAB類型含量低于BBA、BBB、BAB、BHH類型，也均呈極顯著差異。其中BBA類型材料的GABA平均含量最高，達(dá) 10.12 mg/100 g;AAB類型材料平均含量最低，為3.30 mg/100 g;BBA類型材料是AAB的3.07倍。綜上，F(xiàn)2、F4代群體中，GABA平均含量最低的均為AAB類型材料，且含量有下降趨勢，BBA類型材料從F2到F4代變?yōu)樽罡?，且平均含量有所提高?/p>

2.4?不同基因組合類型間GABA含量的比較

由表5可以看出，F(xiàn)2代中，純合AAB基因組合類型材料γ-氨基丁酸含量的平均值為（5.98±1.15） mg/100 g，變異范圍為3.77～7.98 mg/100 g，變異系數(shù)為1930%;純合BBA基因組合類型材料γ-氨基丁酸含量的平均值為（9.87±1.24） mg/100 g，變異范圍為 8.18～12.15 mg/100 g，變異系數(shù)為1256%。由表6可以看出，F(xiàn)4代中，純合AAB基因組合類型材料γ-氨基丁酸含量的平均值為（3.30±0.47） mg/100 g，變異范圍為2.99～4.10 mg/100 g，變異系數(shù)為14.11%;純合BBA基因型材料γ-氨基丁酸含量的平均值為（10.12±121） mg/100 g，變異范圍為8.10～12.08 mg/100 g，變異系數(shù)為11.96%。綜上， 從F2代到F4代，純合AAB、BBA基因組合類型材料變異系數(shù)均有降低，其中AAB降低幅度較大，且均值都有向其最低或最高方向變化的趨勢。由表5、表6還可以看出，雜合基因型材料變異系數(shù)不穩(wěn)定。

2.5?純合高含量與低含量基因組合類型材料符合度的比較

為進(jìn)一步探究純合高含量基因組合類型BBA和純合低含量基因組合類型AAB材料的穩(wěn)定性，對這2種組合類型的符合度進(jìn)行了統(tǒng)計。結(jié)果（表7）表明，F(xiàn)2、F4代中BBA類型材料的符合度均為50%，AAB類型材料的符合度分別為53%、75%，相比純合高含量基因組合類型材料，純合低含量基因組合類型材料的符合度隨著世代增加有所增加，說明純合低含量基因組合類型材料穩(wěn)定性更高。

3?結(jié)論與討論

3.1?水稻籽粒中γ-氨基丁酸含量測定方法比較

γ-氨基丁酸作為一種新型的功能性因子，其測定方法目前在我國還沒有明確統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。比色法和高效液相色譜法（HPLC）是這些年比較常用的2種測定γ-氨基丁酸含量的方法，但是均有優(yōu)缺點。比色法利用游離氨基酸與苯酚和次氯酸鈉反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，進(jìn)行比色測定。這一方法操作簡便，設(shè)備簡單，適合大規(guī)模測定。但是水稻糙米中的GABA含量普遍較低，所以在對其進(jìn)行檢測時，其他物質(zhì)產(chǎn)生的顏色會對分光光度計顯色反應(yīng)造成影響，使其準(zhǔn)確度降低。HPLC檢測的原理是γ-氨基丁酸與一些特殊的化學(xué)試劑發(fā)生柱前衍生反應(yīng)后，生成一種能被紫外-可見光檢測到的穩(wěn)定熒光物。這一方法分離度較高、重復(fù)性較好、精密度較高、結(jié)果比較準(zhǔn)確，但試劑昂貴，程序也較為繁瑣。程威威等對比分析了鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）等作為柱前衍生試劑，檢測發(fā)芽糙米中的γ-氨基丁酸含量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OPA雖然衍生時間比較短，但其衍生產(chǎn)物較不穩(wěn)定，易分解[7，14];Dansyl-Cl衍生過程比較復(fù)雜，不僅需要避光保存，而且其衍生產(chǎn)物也相對較不穩(wěn)定[15];而AQC作為一種較為新型的柱前衍生試劑，衍生反應(yīng)時不僅反應(yīng)迅速，靈敏度較高，而且衍生產(chǎn)物也較為穩(wěn)定[16]。唐濤等在研究中均證實了AQC的優(yōu)越性[17-19]。因此，本試驗采用高效液相色譜法，并用AQC作柱前衍生，檢測籽粒中γ-氨基丁酸含量。

3.2?水稻籽粒γ-氨基丁酸含量與基因型的相關(guān)關(guān)系

王迎超研究發(fā)現(xiàn)，高粱稻-1與寧農(nóng)黑粳雜交組合F1代籽粒γ-氨基丁酸含量介于雙親之間，F(xiàn)2代籽粒γ-氨基丁酸含量呈偏正態(tài)分布，并出現(xiàn)超親現(xiàn)象[2]。本試驗在此基礎(chǔ)上，依據(jù)3個QTL位點，對雜交F2代和F4代進(jìn)行基因型組合分類，具體分析結(jié)果表明，不同基因組合類型與γ-氨基丁酸含量之間呈極顯著相關(guān)，代表高含量純合基因型（BBA組合）中GABA的檢測結(jié)果均值最高，代表低含量純合基因型（AAB組合）中GABA的檢測結(jié)果均值最低，其檢測結(jié)果與基因型表現(xiàn)一致。顯著性分析結(jié)果表明，GABA含量與其基因組合類型之間存在極顯著相關(guān)性。F2代BBA類型材料的GABA平均含量 （9.87 mg/100 g） 是AAB類型材料平均含量（5.97 mg/100 g）的1.65倍，F(xiàn)4代BBA類型材料平均含量（10.12 mg/100 g）是AAB類型材料GABA平均含量（3.30 mg/100 g）的3.07倍。結(jié)果表明，相比于F2代，F(xiàn)4代的BBA組合中GABA的平均含量增高，且F4代的AAB組合中GABA的平均含量降低，變異程度也均有所降低，特別是低含量純合基因型材料符合度從53%上升到75%，其結(jié)果表明，低含量材料γ-氨基丁酸含量趨于穩(wěn)定程度較高。

3.3?富γ-氨基丁酸水稻品種的選育

本試驗在王迎超的研究基礎(chǔ)[2]上進(jìn)行延伸，利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)篩選富γ-氨基丁酸的水稻新材料，不僅可以縮短育種年限，也能快速選擇出富γ-氨基丁酸的水稻新品種。有關(guān)水稻籽粒中控制γ-氨基丁酸含量的遺傳學(xué)研究起步較晚，目前，籽粒中控制γ-氨基丁酸含量的QTL位點并沒有得到精細(xì)定位。本試驗結(jié)果證明，控制GABA基因定位的準(zhǔn)確性，可為分子標(biāo)記輔助選擇富含γ-氨基丁酸的水稻新品種以及控制γ-氨基丁酸含量的候選基因篩選奠定基礎(chǔ)。

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