加速溶劑萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定煙絲中5種羧酸苯乙酯的含量及對煙絲加香的均勻性評價

吳若昕，張春濤，李登科，張小利，張建中，李海霞

(1.上海煙草集團有限責任公司 技術中心天津工作站，天津300163; 2.南開大學 化學學院，天津300071)

卷煙加香是制絲生產(chǎn)中的一道重要工序，加香的均勻性直接影響卷煙產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性[1-3]。目前行業(yè)主要通過計算添加到煙絲中的香精標記物含量的變異系數(shù)來評價加香工序的均勻性，文獻中大多選取一種或少數(shù)幾種香精組分作為標記物[4-7]。選取的標記物可能少量存在于煙絲中，對其測定結(jié)果造成干擾，或者雖在煙絲中未發(fā)現(xiàn)，但僅選取一種組分不足以系統(tǒng)評價整個加香工序[8-10]。因此，選取一系列香精和煙絲組分以外的化合物作為外加標記物，在卷煙加香均勻性研究中具有獨特的優(yōu)勢，但目前尚未有相關文獻報道。

對多種代表性煙用香精進行定性分析時發(fā)現(xiàn)香精中酯類化合物種類較多且對香氣品質(zhì)起關鍵作用。羧酸苯乙酯類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與香精中多種酯類化合物相似，在多種香精中未添加且不存在于煙草本底中，適量外加后不會對卷煙感官質(zhì)量產(chǎn)生明顯的影響，且沸點分布均勻，適合作為評價加香均勻性的外加標記物。本工作根據(jù)沸點均勻分布原則選取了甲酸苯乙酯、乙酸苯乙酯、丙酸苯乙酯、丁酸苯乙酯和苯乙酸苯乙酯等5種羧酸苯乙酯類化合物作為外加標記物，除了丙酸苯乙酯外，其他4種羧酸苯乙酯類化合物均收錄在YQ 52－2015《煙草制品許可使用的添加劑名單》和YQ 53－2015《煙草制品臨時許可使用的添加劑名單》中，丙酸苯乙酯雖未涵蓋，但同屬于常用的食用香精，可酌情使用。

加速溶劑萃取法(ASE)是利用液體溶劑對流動性差的樣品進行萃取，通過增加萃取溶劑的溫度和壓力來提高被分析物的溶解性，降低溶劑黏度，加速溶劑向基體的擴散，從而提高萃取過程的速率和效率[11-12]。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)能有效降低背景噪聲，改善選擇性和靈敏性，具有很強的抗基質(zhì)干擾能力，是復雜基質(zhì)中痕量化合物檢測的理想分析方法。本工作基于ASE的特殊構(gòu)造，將煙草樣品的提取過程和凈化過程同時進行，采用GCMS/MS同時測定煙草中5種羧酸苯乙酯的含量，方法高效快速，定量準確，實際應用效果顯著。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A-7000B型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;Dionex ASE 350型加速溶劑萃取儀;KQ-600DE 型超聲波清洗器;F-105 型循環(huán)冷卻水泵;XS204 型電子天平;0.45μm 尼龍有機相過濾膜。

5 種羧酸苯乙酯的混合標準儲備溶液:10.00 g·L－1，分別稱取5 種羧酸苯乙 酯 標準品0.500 0 g，用正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至50 m L 容量瓶中，用正己烷定容，混合均勻，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

5種羧酸苯乙酯的混合標準溶液:100 mg·L－1，移取5 種羧酸苯乙酯的混合標準儲備溶液0.50 m L于50 m L容量瓶中，用正己烷定容，混合均勻，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標儲備溶液:10.00 g·L－1，稱取乙酸苯甲酯基準品0.500 0 g，用正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中，用正己烷定容，混合均勻，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標溶液:100 mg·L－1，移取內(nèi)標儲備溶液0.50 m L于50 m L容量瓶中，用正己烷定容，混合均勻，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

5種羧酸苯乙酯的混合標準溶液系列:分別移取0.05，0.25，0.50，2.50，5.00 m L 的5種 羧 酸 苯 乙酯的混合標準溶液于50 m L 容量瓶中，各加入0.50 m L內(nèi)標溶液，用正己烷定容，配制成0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 mg·L－1的5種羧酸苯乙酯混合標準溶液系列。

甲醇、異丙醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯均為色譜純;乙酸苯乙酯為分析純;甲酸苯乙酯(純度為95%)、乙酸苯乙酯(純度為99%)、丙酸苯乙酯(純度為98%)、丁酸苯乙酯(純度為98%)和苯乙酸苯乙酯(純度為98%)等5種標準品;內(nèi)標物乙酸苯甲酯(純度為98%)。

A 牌香精樣品和A 牌卷煙樣品由某卷煙廠提供。

1.2 儀器工作條件

1)萃取條件 萃取溶劑為正己烷;萃取溫度為100 ℃;萃取壓力為10.34 MPa;加熱時間為5 min;靜態(tài)萃取時間為5 min;氮氣吹掃時間為60 s;循環(huán)次數(shù)為2次。

2)色譜條件 HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);進樣口溫度為290 ℃;載氣為高純氦氣，純度為99.999%;流量 為1.0 m L·min－1;進樣量為1μL;分流進樣，分流比為10∶1。柱升溫程序:初始溫度為60 ℃，保持2 min;以5 ℃·min－1的速率升溫至280 ℃，保持10 min。

3)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI);電離能量為70 e V;離子源溫度為260 ℃;四極桿溫度為150 ℃;傳輸線溫度為280 ℃;多反應監(jiān)測(MRM)模式;NIST 譜庫。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種羧酸苯乙酯和內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of the 5 phenyl ethyl carboxylates and internal standard

1.3 試驗方法

將煙絲樣品置于溫度(20±1)℃、相對濕度(60±3)%條件下平衡24 h。稱取4.0 g樣品置于34 m L萃取池中進行加速溶劑萃取，得到樣品萃取溶液，向樣品萃取溶液中加入質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的內(nèi)標溶液0.50 m L，經(jīng)過0.45μm尼龍有機相濾膜過濾，得到濾液，按照儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取方法的選擇

試驗比較了ASE和超聲輔助萃取法(UAE)對5種羧酸苯乙酯的回收率和測定值相對標準偏差(RSD)的影響，結(jié)果見表2。

表2 ASE與UAE對5種羧酸苯乙酯回收率的比較(n＝6)Tab.2 Comparison on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates by ASE and UAE(n＝6) %

結(jié)果表明:ASE 和UAE 對5種羧酸苯乙酯的回收率和RSD 均滿足要求，部分羧酸苯乙酯的回收率在ASE 條件下較UAE 條件下略高。這是由于ASE在高溫、高壓條件下進行，使得溶劑表面張力下降，提高了萃取效果;UAE在實驗室較為普及，且操作簡單;相比之下，ASE具有萃取時間短、自動化程度高、穿透能力強和萃取效率高等優(yōu)點。試驗選擇的萃取方法為ASE。

2.2 加速溶劑萃取條件的選擇

2.2.1 萃取溶劑

一般選用甲醇、異丙醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯等萃取溶劑提取煙草中的致香成分[13-14]。試驗比較了上述不同種類的萃取溶劑對5種羧酸苯乙酯的萃取效果和基質(zhì)干擾情況，結(jié)果見圖1。

結(jié)果表明:甲醇和二氯甲烷對5種羧酸苯乙酯的回收率較大，但同時萃取出的雜質(zhì)最多，造成色譜峰的基線位置升高，且存在基質(zhì)效應影響測定結(jié)果的準確度;異丙醇和乙腈對5種羧酸苯乙酯的回收率較小，回收率為68.8%～89.5%;乙酸乙酯為萃取溶劑時，在16.84 min內(nèi)，目標化合物出峰處有一個共流出物，不能完全分離。綜合考慮，試驗選擇萃取效率較高且基質(zhì)干擾較小的正己烷作為萃取溶劑。2.2.2 萃取溫度

圖1 不同種類的萃取溶劑對5種羧酸苯乙酯回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

萃取溫度是影響ASE 萃取效果的最主要因素之一。提高萃取溫度能提高目標物的溶解能力，降低溶劑與樣品基體之間的作用力，提高萃取效率;但萃取溫度過高可能導致目標物降解，同時導致溶劑密度增大，擴散系數(shù)降低，萃取效率降低。試驗考察了萃取溫度分別為60，80，100，120，140℃時對5種羧酸苯乙酯回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同萃取溫度對5種羧酸苯乙酯回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction temperatures on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由圖2可知:當萃取溫度為60，80℃時，甲酸苯乙酯的回收率較低，分別為78.1%，81.3%;當萃取溫度為100 ℃時，5 種羧酸苯乙酯的回收率為95.5%～101%，滿足分析要求;當萃取溫度繼續(xù)升高至120 ℃時，5種羧酸苯乙酯的回收率趨于穩(wěn)定;繼續(xù)升高萃取溫度，5種羧酸苯乙酯的回收率反而降低?？紤]到萃取溫度越高消耗的能量越多，試驗選擇的萃取溫度為100 ℃。

2.2.3 靜態(tài)萃取時間

延長靜態(tài)萃取時間能增加目標物向萃取試劑中擴散，進而提高萃取效率，但是高溫條件下延長靜態(tài)萃取時間可能會發(fā)生熱降解，降低萃取效率。試驗考察了靜態(tài)萃取時間分別為5，10，15，20，25 min時對5種羧酸苯乙酯回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同靜態(tài)萃取時間對5種羧酸苯乙酯回收率的影響Fig.3 Effect of different static extraction time on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由圖3可知:當靜態(tài)萃取時間為5 min時，5種羧酸苯乙酯的回收率為96.2%～104%;繼續(xù)延長靜態(tài)萃取時間，5種羧酸苯乙酯的回收率無顯著性變化。為了縮短分析時間，試驗選擇的靜態(tài)萃取時間為5 min。

2.2.4 循環(huán)萃取次數(shù)

試驗將靜態(tài)萃取時間分至不同的循環(huán)過程中，而非單純延長單次萃取時間，能夠在萃取中間引入新鮮溶劑，有助于保持溶劑與樣品之間的平衡，特別是對于高含量樣品或者難萃取的樣品。試驗考察了循環(huán)次數(shù)分別為1，2，3次時對5種羧酸苯乙酯回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同的循環(huán)次數(shù)對5種羧酸苯乙酯回收率的影響Fig.4 Effect of different cycling times on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由圖4可知:當循環(huán)次數(shù)為2次時，5種羧酸苯乙酯的回收率達到較大值;繼續(xù)增加循環(huán)次數(shù)，5種羧酸苯乙酯的回收率無顯著性變化。為了減少有機溶劑的使用量，試驗選擇的循環(huán)萃取次數(shù)為2次。

2.2.5 樣品量

當ASE中萃取溶液的體積一定時，煙絲樣品量會影響方法的檢出限和萃取效率。試驗對樣品量進行了選擇。考慮到萃取池體積，試驗考察了在相同萃取條件下3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 g煙絲樣品的萃取效率，結(jié)果見圖5。

圖5 不同的樣品量對5種羧酸苯乙酯回收率的影響Fig.5 Effect of different amounts of sample taken on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由圖5 可 知:當 煙 絲 樣 品 量 為3.0，4.0 g 時，5種羧酸苯乙酯的回收率均較大，分別為90.1%～102%及93.1%～106%。由于樣品量越大，方法檢出限越低，試驗選擇煙絲樣品量為4.0 g。

2.3 基質(zhì)效應

煙草基質(zhì)非常復雜，存在明顯的基質(zhì)效應，試驗采用乙酸苯甲酯作為內(nèi)標物，考察了內(nèi)標法和外標法對消除基質(zhì)效應的作用。按照試驗方法對加標量為1.00μg·g－1的煙草樣品進行測定，由內(nèi)標法和外標法計算5種羧酸苯乙酯的加標回收率，結(jié)果見圖6。

圖6 5種羧酸苯乙酯在內(nèi)標法和外標法下的回收率Fig.6 Recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates by internal and external standard methods

由圖6可知:由外標法計算的5種羧酸苯乙酯的回收率明顯高于內(nèi)標法，這可能是由于基質(zhì)成分的存在減少了色譜系統(tǒng)活性位點與目標物分子作用的機會，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，使得待測物的信號強度增強，表現(xiàn)為回收率偏高;而采用內(nèi)標法計算的5種羧酸苯乙酯的回收率更接近于100%，說明試驗采用內(nèi)標法可以顯著消除基質(zhì)效應。

2.4 標準曲線與檢出限

按照儀器工作條件對5種羧酸苯乙酯的混合標準溶液系列進行測定，以各羧酸苯乙酯的質(zhì)量濃度為橫坐標，與其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明:5 種羧酸苯乙酯的質(zhì)量濃度均在0.10～10.00 mg·L－1內(nèi)與其對應的峰面積之間呈線性關系，線性回歸方程和相關系數(shù)見表3。

以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)，結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)和檢出限Tab.3 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度和回收試驗

平行稱取空白卷煙樣品6份，分別對其添加低、中和高等3種濃度水平的5種羧酸苯乙酯混合標準溶液，按照試驗方法對其測定，計算5種羧酸苯乙酯的回收率和測定值的RSD，結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

空白卷煙樣品和加標量為1.00μg·g－1的樣品在MRM 模式下的色譜圖見圖7。

2.6 均勻性評價

2.6.1 含有外加標記物香精的制備及加香后煙絲的取樣

香精制備:在A 牌香精中添加一定質(zhì)量濃度的5種羥酸苯乙酯混合標準溶液，制成5種羧酸苯乙酯的質(zhì)量濃度約為400 g·L－1的香精，用于卷煙加香。

煙絲加香:A 牌煙絲經(jīng)過加香滾筒時，將含有5種羧酸苯乙酯的香精噴灑到煙絲中完成卷煙加香工序，加香工藝參數(shù)與在線保持一致。

加香后煙絲的取樣:待設備運行平穩(wěn)后，從加香滾筒出口固定位置取樣，取樣時間間隔1 min，每次取樣100 g。

2.6.2 同一生產(chǎn)批次內(nèi)卷煙加香均勻性

某生產(chǎn)批次A 牌煙絲按2.6.1節(jié)加香后取樣，共取10個樣品，標記為樣品1～10，測定外加標記物的含量并計算其含量的變異系數(shù)CVi，表征5種羧酸苯乙酯加到煙絲中的均勻性，結(jié)果見表5。

5種羧酸苯乙酯的變異系數(shù)CVi依次為8.8%，6.4%，5.8%，8.1%，8.4%，均小于9%，代表該生產(chǎn)批次內(nèi)卷煙加香均勻性良好。

2.6.3 不同生產(chǎn)批次間卷煙加香均勻性

A 牌煙絲連續(xù)10個生產(chǎn)批次，標記為批次1～10，按2.6.1 節(jié)加香后取樣，測定外加標記物的含量，并計算其含量的變異系數(shù)CVi，表征5種羧酸苯乙酯加到煙絲中的均勻性，結(jié)果見表6。

5種羧酸苯乙酯的變異系數(shù)CVi依次為7.2%，8.4%，7.0%，6.8%，6.3%，均小于9%，代表不同生產(chǎn)批次間卷煙加香均勻性良好。

本方法為卷煙加香工序提供了一種高效、準確的評價方法，有助于卷煙產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

圖7 MRM 模式下空白卷煙樣品和加標樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of blank and standard-added cigarette samples under MRM mode

表5 同一生產(chǎn)批次內(nèi)煙絲中5種羧酸苯乙酯的加香均勻性評價Tab.5 Evaluation of aromatizing uniformity of the 5 phenyl ethyl carboxylates in cut tobacco from same production batch μg·g－1

表6 不同生產(chǎn)批次間煙絲中5種羧酸苯乙酯的加香均勻性評價Tab.6 Evaluation of aromatizing uniformity of the 5 phenyl ethyl carboxylates in cut tobacco from different production batches μg·g－1