香蕉葉縮合單寧超聲提取工藝優(yōu)化

賴曉琳， 張 剛，黃建軍

(漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,福建漳州 363000)

0 引言

單寧，又稱為五倍子單寧酸，在自然界中廣泛存在，屬于天然可再生資源，其在醫(yī)藥化工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景.根據(jù)單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，可將其分為可水解單寧和縮合單寧.縮合單寧又稱為原花色素，其是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，具有C6-C3-C6的結(jié)構(gòu)特征[1].目前，縮合單寧的提取主要有水浴浸提[2]、微波輔助[3]、超聲波輔助[4]等方法.超聲波輔助提取能有效縮短提取時間，提高了提取率，因此受到了研究者的青睞.近年來，國內(nèi)外對香蕉葉的研究主要是蛋白的提取，多糖的提取，纖維素的提取，而對香蕉葉縮合單寧的提取鮮有報(bào)道.

響應(yīng)面優(yōu)化法是一種實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)的方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題.它囊括了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮线m性、尋求最佳組合條件等.通過對過程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制、可方便的求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值.在各因素水平響應(yīng)值的基礎(chǔ)上，可以找出預(yù)測的響應(yīng)最優(yōu)值以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件.于正交試驗(yàn)相比其優(yōu)勢是：在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)的對實(shí)驗(yàn)的各個水平進(jìn)行分析，而正交試驗(yàn)只能對一個個孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析.

本研究以漳州市天寶鎮(zhèn)的香蕉葉為原料提取縮合單寧，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化其超聲提取工藝，希望能為香蕉葉資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料試劑

香蕉葉：采于福建省漳州市天寶鎮(zhèn)；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁公司；無水甲醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、無水乙醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、濃鹽酸(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、香草醛(阿拉丁公司)均為分析純；水為去離子水.

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子分析天平(紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司)；KEJ-1000超聲波清洗機(jī)功率480 W(張家港科凈)；T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司)；BJ-150中藥粉碎機(jī)(德清拜杰)；101-1A立式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津通利信達(dá)).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香蕉葉粉的制備 取新鮮香蕉葉，用去離子水洗凈，在50 ℃下烘干24 h，粉碎，過100目篩，干燥避光保存.

1.3.2 香蕉葉中縮合單寧的提取 準(zhǔn)確稱取1.0 g 的香蕉葉粉末，裝入100 mL具塞錐形瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件加入乙醇溶液后，在超聲波清洗器中提取，提取完畢過濾，濾液作為香蕉葉縮合單寧提取物樣液備用.

1.3.3 縮合單寧的測定 取0.5 mL香蕉葉縮合單寧提取物，加入3 mL 4 % 香草醛甲醇溶液和1.5 mL濃鹽酸，充分搖勻后在30 ℃水浴中反應(yīng)20 min[5]，在500 nm波長下用紫外分光光度計(jì)測定其吸光度，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得縮合單寧質(zhì)量濃度，繼而進(jìn)行香蕉葉縮合單寧的提取量的計(jì)算.

香蕉葉縮合單寧提取量(mg/g)=( V×ρ)/ (ω×1000)

(1)

式 中：V—提取液體積，mL；ρ—待測樣液中縮合單寧的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；ω—香蕉葉粉末的質(zhì)量，g.

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The Standard Curve of Catechin

1.3.4 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.5 mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3 mL 4 %香草醛甲醇溶液和1.5 mL濃鹽酸，充分搖勻后在30 ℃水浴中反應(yīng)20 min[5]，在500 nm波長下用紫外分光光度計(jì)測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 2.600 02x+ 0.010 2，R2=0.999 7

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)提取時間對香蕉葉縮合單寧提取量的影響

以80 %的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，超聲波功率50 %，提取時間分別為10，20，25，30，40 min.測定香蕉葉縮合單寧的提取量.

(2)乙醇濃度對香蕉葉縮合單寧提取量的影響

分別以70 %，75 %，80 %，85 %，90 %的乙醇為提取劑，在液料比30 mL·g-1，超聲波功率為50 %的條件下，提取時間25 min.測定香蕉葉縮合單寧的提取量.

(3)液料比對香蕉葉縮合單寧提取量的影響

以85 %的乙醇為提取劑，分別在液料比20，25，30，35，40 mL·g-1，超聲波功率50 %的條件下，提取時間25 min.測定香蕉葉縮合單寧的提取量.

(4)超聲功率對香蕉葉縮合單寧提取量的影響

以80 %的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，超聲功率分別為20 %，40 %，50 %，60 %，80 %的條件下，提取時間30 min.測定香蕉葉縮合單寧的提取量.

1.3.6 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方案 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取提取時間、乙醇濃度、液料比、超聲功率4個因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平如表1所示.

表1 因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 Design of Factor Level

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取時間的影響Fig.2 The Effect of Extraction Time

2.1.1 提取時間對香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖2所示，以80% 的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，超聲功率50%的條件下，隨著提取時間的增加，香蕉葉縮合單寧的提取量在25 min內(nèi)逐漸增大，在25 min時，達(dá)最大值為6.69 mg·g-1，當(dāng)超聲波處理時間繼續(xù)延長時，縮合單寧提取量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，其原因可能是因?yàn)楫?dāng)提取時間達(dá)到25 min時，縮合單寧幾乎完全被提取出來，繼續(xù)延長提取時間，會引起縮合單寧的降解和氧化[6]，因此選取25 min為最優(yōu)的提取時間.

圖3 乙醇濃度的影響Fig.3 The Effect of Ethanol Concentration

2.1.2 乙醇濃度對香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖3所示，在液料比30 mL·g-1，超聲波功率為50 %的條件下，提取時間25 min的條件下，隨著乙醇濃度的增大，縮合單寧的提取量先增大后減小，在85 % 時達(dá)到最大值，其原因可能是過高的乙醇濃度，使某些醇溶性、酯溶性雜質(zhì)溶出量增加，與縮合單寧產(chǎn)生競爭性溶出，導(dǎo)致提取量的下降[7],故選擇乙醇的濃度為85 %.

2.1.3 液料比對香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖4所示，以85 % 的乙醇為提取劑，超聲波功率50 % 的條件下，超聲波作用25 min的條件下，隨著液料比的增大，縮合單寧的提取量逐漸增大，在液料比為25 mL·g-1時達(dá)到最大，在增大液料比，提取量反而有所下降.這是因?yàn)橐毫媳仍龃罂稍黾蛹?xì)胞內(nèi)外質(zhì)量濃度差，有利于縮合單寧的提取，但同時也會導(dǎo)致系統(tǒng)中單位體積提取液超聲能量密度的降低，不利于縮合單寧的提取[8].因此，選擇液料比為25 mL·g-1.

2.1.4 超聲功率對香蕉葉縮合單寧提取量的影響 如圖5所示，以80% 的乙醇為提取劑，液料比30 mL·g-1，提取時間30 min的條件下，隨著超聲功率的增大，縮合單寧的提取量逐漸升高，在超聲波功率為50 % 時，縮合單寧的提取量達(dá)到最大值，之后再升高超聲波的功率，提取率開始下降.可能是因?yàn)殡S著功率的增大，超聲波的空化效應(yīng)增強(qiáng)，加速了香蕉葉中縮合單寧的溶出，但功率過大，會使溶劑溫度升高且較強(qiáng)的超聲波空化效應(yīng)會破壞縮合單寧分子的結(jié)構(gòu)，使提取量降低.因此適合的超聲波功率為50 %.

圖4 液料比的影響Fig.4 The Effect of Liquid-solid Ratio圖5 超聲功率的影響Fig.5 The Effect of Ultrasonic Power

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Design-Expert 8.0.6的Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，共得29個試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個為析因點(diǎn)，5個為中心點(diǎn).香蕉葉縮合單寧提取量為響應(yīng)值，響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 The Experimental Design and Results of Response Surface Analysis

表3 方差分析表Tab.3 The Analysis of Variance Table

2.2.2 回歸方程擬合和方差分析 將表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立回歸模型，得到香蕉葉縮合單寧的提取量(Y)與提取時間(A)、乙醇濃度(B)、液料比(C)、超聲功率(D)的二次多元回歸方程為：

Y=7.07 + 0.013 A + 0.038 B + 0.59 C + 0.17 D + 0.035 AB + 0.085 AC - 0.010 AD - 0.20 BC + 0.14 BD - 0.015 CD - 0.36 A2- 0.45 B2- 0.48 C2- 0.59 D2

由回歸方程可得出，各因素對香蕉葉縮合單寧提取量的影響大小順序?yàn)橐毫媳?超聲功率>乙醇濃度>提取時間.

響應(yīng)曲面各因素的方差結(jié)果見表3，由表3中的數(shù)據(jù)可得，該回歸方程模型的P<0.01模型極顯著，而失擬項(xiàng)不顯著(P=0.088 3 >0.05)，差異不顯著.模型的確定系數(shù)R2=0.994 5，調(diào)整系數(shù)RAdj2= 0.989 1，說明建立的模型能夠解釋98.91 % 響應(yīng)值的變化，且有99.45 %來源于所選變量.除了一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AC影響顯著和一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB、AD、CD影響不顯著之外，一次項(xiàng)C、D，交互項(xiàng)BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均影響極顯著.

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 如圖6-11圖所示，香蕉葉縮合單寧提取量隨提取時間、乙醇濃度、液料比、超聲功率的增大而增大，達(dá)到各因素中心值后，香蕉葉縮合單寧提取量隨各因素的增大而減小.液料比對香蕉葉縮合單寧的提取量影響最大，表現(xiàn)為曲面較為陡峭，因此控制好液料比對于提取效果十分重要.超聲功率對于香蕉葉縮合單寧的提取量僅次于液料比，再次是乙醇濃度.提取時間變化幅度平緩，說明此因素對縮合單寧提取量影響較小.比較各圖可知，乙醇濃度與液料比及乙醇濃度與超聲功率的相互作用對縮合單寧的提取量影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面圖較陡峭；而提取時間與乙醇濃度及提取時間和超聲功率的相互作用對縮合單寧的提取量影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較平緩.

圖6 乙醇濃度與提取時間對縮合單寧提取量的影響Fig.6 Effect of Ethanol Concentration and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖7 液料比與提取時間對縮合單寧提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-solid Ratio and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖8 超聲功率與提取時間對縮合單寧提取量的影響Fig.8 Effect of Ultrasonic Power and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖9 液料比與乙醇濃度對縮合單寧提取量的影響Fig.9 Effect of Liquid-solid Ratio and Ethanol Concen-tration on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖10 超聲功率與乙醇濃度對縮合單寧提取量的影響Fig.10 Effect of Ultrasonic Power and Ethanol Concen-tration on Extraction Capacity of Condensed Tannins圖11 超聲功率與液料比對縮合單寧提取量的影響Fig.11 Effect of Ultrasonic Power and Liquid-solid Ratio on Extraction Capacity of Condensed Tannins

2.2.4 最優(yōu)工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證 響應(yīng)面提取香蕉葉縮合單寧的最優(yōu)工藝條件為：提取時間25.44 min，乙醇濃度84.64 %，液料比28.13 mL·g-1，超聲功率51.29 %，此條件下縮合單寧提取量預(yù)測值為7.27 mg·g-1.為符合實(shí)際操作，將最優(yōu)提取條件微調(diào)為：提取時間25 min，乙醇濃度85 %，液料比28 mL·g-1，超聲功率50 %，進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所測得縮合單寧提取量的平均值為7.15 mg·g-1，與預(yù)測值相對誤差只有1.65 % ，說明利用響應(yīng)面優(yōu)化的方法有效，具有實(shí)際應(yīng)用性.

3 結(jié)論

本文通過考察提取時間、乙醇濃度、液料比、超聲功率對香蕉葉縮合單寧提取量的影響，利用響應(yīng)面法分析獲得提取香蕉葉縮合單寧的最佳條件為：提取時間25.44 min，乙醇濃度84.64 %，液料比28.13 mL·g-1,超聲功率51.29 %，此條件下縮合單寧提取量預(yù)測值為7.27 mg·g-1；實(shí)際微調(diào)工藝條件為：提取時間25 min，乙醇濃度85 %，液料比28 mL·g-1,超聲功率50 %，實(shí)際提取率為7.15 mg·g-1，與理論值相對誤差為1.65 %，驗(yàn)證了最優(yōu)提取工藝的有效性，為香蕉葉縮合單寧資源利用與研究提供參考.