長白瑞香提取物的急性毒性及其體外抗弓形蟲的研究

趙鵬宇， 徐樂樂， 金春美， 張昌浩， 金莉莉

( 延邊大學(xué) 藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002 )

長白瑞香(DaphnekoreanaNakai)為瑞香科瑞香屬落葉小灌木，又名辣根草、祖師麻，是長白山區(qū)的特有植物[1].長白瑞香性味辛、熱，有溫中散陽、行癖止痛等功效[2]，亦有鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抑制蛋白激酶活性、抗瘧、保肝等藥理活性[3-5].目前學(xué)者已對長白瑞香的化學(xué)成分進(jìn)行了較多研究，發(fā)現(xiàn)其主要含有瑞香素、瑞香苷、西瑞香素、傘形花內(nèi)酯等[4-8].

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)簡稱弓形蟲或弓形體，廣泛寄生于人和多種動物的有核細(xì)胞內(nèi)，是一種重要的機(jī)會致病原蟲( opportunistic protozoa)，可引起弓形蟲病(toxoplasmosis).目前治療弓形蟲病主要依靠抗生素、磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等化學(xué)藥物，但研究顯示這些藥物治療弓形蟲病的效果并不理想，且毒副作用大[9].近年來一些植物相繼被報道具有良好的抗弓形蟲活性[10-11]，但對于長白瑞香抗弓形蟲作用的研究尚未見報道.基于此，本文對長白瑞香提取物的急性毒性及其體外抗弓形蟲作用進(jìn)行研究，以此為長白瑞香的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

長白瑞香樣品采于吉林省安圖縣二道白河鎮(zhèn)(采集日期為2018年8月)，經(jīng)延邊大學(xué)生藥教研室呂惠子教授鑒定；昆明小鼠(體重為18～23 g)，延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動物中心提供；弓形蟲RH株、HeLa細(xì)胞，延邊大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)室提供；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液，北京Solarbio公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，美國GIBCO公司；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)，Thermo公司；乙胺嘧啶片，廣州白云山光華制藥股份有限公司；無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；無菌生理鹽水，龍井草仙藥業(yè)有限公司；MTT溶液，美國Amresco公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平，上海精天電子儀器有限公司；低速離心機(jī)，德國SIGMA公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； SH-1000 Lab型酶標(biāo)儀，日本Corona Electric公司；WZ-180SP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；HH-W型恒溫水浴箱，浙江金壇市恒豐儀器廠；SW-CJ凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 長白瑞香提取物的制備

將2.0 kg長白瑞香干燥藥材粉碎，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乙醇超聲提取3次，減壓蒸發(fā)得到550.0 g乙醇提取物.在提取物中加入適量蒸餾水并將乙醇提取物均勻混懸，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶劑等體積萃取3次.將各層萃取液合并，減壓濃縮后得到石油醚萃取物27.3 g，二氯甲烷萃取物11.0 g，乙酸乙酯萃取物50.2 g，正丁醇萃取物82.3 g.

2.2 長白瑞香乙醇提取物的急性毒性實(shí)驗(yàn)

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品安全性毒理學(xué)評價程序》(GB 15193.1—2014)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).取昆明小鼠18只，隨機(jī)分成3組(對照組、低劑量組、高劑量組，每組6只)并稱重.采用最大耐受量法[12]測定小鼠口服長白瑞香乙醇提取物的急性毒性.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將低劑量組的給藥量設(shè)置為5 g/kg，高劑量組的給藥量設(shè)置為10 g/kg.小鼠禁食不禁水12 h后，對小鼠采用灌胃給藥法等體積給藥，各組給藥體積均為0.4 mL/10 g.觀察、記錄小鼠在給藥期間的反應(yīng)癥狀(觀察期為14 d)，并在第15 d解剖所有小鼠，觀察其心、肝、脾、肺、腎等臟器有無病理變化[13-14].

2.3 長白瑞香提取物的體外抗弓形蟲實(shí)驗(yàn)

2.3.1弓形蟲懸液的制備 將保存于液氮罐中的弓形蟲凍存管置于37 ℃預(yù)熱的恒溫水浴鍋內(nèi)迅速溶解，然后將融化后的弓形蟲懸液接種于小鼠腹腔；連續(xù)傳代至小鼠體內(nèi)弓形蟲毒性穩(wěn)定后，處死發(fā)病體征明顯且病危的小鼠.用無菌生理鹽水清洗小鼠腹腔并收集腹腔液，然后以500 r/min離心(5 min)腹腔液；取上清液再以2 500 r/min離心20 min，棄上層離心液后向蟲體沉淀中加入適量含2%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM并混勻，備用.

2.3.2HeLa細(xì)胞的培養(yǎng) 取HeLa細(xì)胞，將其培養(yǎng)在含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM中，然后加入1 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將細(xì)胞懸液置于15 mL離心管中，以1 000 r/min離心3 min.棄上清液，取適量細(xì)胞放入新的培養(yǎng)皿中，取適量細(xì)胞放入含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM中進(jìn)行傳代培養(yǎng).

2.3.3HeLa細(xì)胞增殖的測定 HeLa細(xì)胞增殖的測定采用MTT法.收集生長狀況穩(wěn)定的HeLa細(xì)胞，然后將HeLa細(xì)胞接種于96孔板中(每孔為3×103個細(xì)胞)，并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以獲得單細(xì)胞層.將含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM更換為含2%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM，并在每個孔中加入5倍HeLa細(xì)胞個數(shù)的弓形蟲，然后在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)完成后，去掉培養(yǎng)液并加入不同濃度(20、200、500 μg/mL)的長白瑞香提取物以測定受試藥物細(xì)胞毒性，同時以乙胺嘧啶為陽性對照，每個濃度設(shè)3個平行孔.另設(shè)正常組作為空白對照，不添加任何物質(zhì).24 h后，在孔中加入10 μL MTT溶液，37 ℃溫育4 h后利用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(λ=548 nm)，并計算3個孔的平均吸光度(OD)值，以此來表示各組蟲體的生長情況.

相同實(shí)驗(yàn)條件下，同時測定不同組別的長白瑞香提取物對未感染的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性.根據(jù)最終測定的OD值，按照式(1)計算各組細(xì)胞的抑制率(cell inhibitory rate，CIR)，按照式(2)計算藥物的選擇性指數(shù)(selectivity index，SI).

(1)

SI=A1/A2.

(2)

其中：A1和A2分別為提取物對未感染弓形蟲的HeLa細(xì)胞和對感染弓形蟲的HeLa細(xì)胞的IC50.

3 結(jié)果與分析

3.1 長白瑞香乙醇提取物的急性毒性測定

3.1.1小鼠體重變化及死亡率 在小鼠的急性毒性試驗(yàn)觀察期內(nèi)(14 d)，各組小鼠外觀正常，生長發(fā)育良好，未見有異常行為和中毒表現(xiàn)，且均無死亡出現(xiàn).對高劑量組的小鼠進(jìn)行剖檢未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變.觀察期內(nèi)各組小鼠體重變化如圖1所示.由圖1可以看出，觀察期內(nèi)高、低劑量組和對照組的小鼠體重變化趨勢基本一致.

3.1.2小鼠行為學(xué)及外觀觀察 觀察期內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組(高、低劑量組和對照組)小鼠的攝食、飲水、其他活動以及糞便、毛色、皮膚等均未見異常.由此根據(jù)急性毒性分級的標(biāo)準(zhǔn)[15]可確定長白瑞香的LD50大于10 g/(kg·BW)，屬實(shí)際無毒.

3.2 長白瑞香提取物的體外抗弓形蟲作用

3.2.1HeLa細(xì)胞的生存抑制效果 圖2為長白瑞香提取物對感染弓形蟲后的HeLa細(xì)胞的生存抑制效果.圖2采用Graphpad prism 7作圖，用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差處理.當(dāng)P<0.01時，圖中用##表示；當(dāng)P<0.001時，圖中用###表示.

圖1 3組小鼠口服長白瑞香乙醇提取物后的體重變化趨勢

圖2 長白瑞香提取物對感染后的HeLa細(xì)胞的生存抑制效果

由圖2可以看出：質(zhì)量濃度在20、200、500 μg/mL時，長白瑞香乙醇提取物及其石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物對感染弓形蟲后的HeLa細(xì)胞的生存均有抑制作用，且質(zhì)量濃度在20～500 μg/mL范圍內(nèi)，對感染后的HeLa細(xì)胞有劑量依賴性的抑制作用，其中二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物的效果較為明顯(P<0.001)，正丁醇萃取物在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時對HeLa細(xì)胞生存的抑制作用最弱(P<0.01).

3.2.2抗弓形蟲作用的選擇性 表1給出了不同組別對感染弓形蟲前后的HeLa細(xì)胞的IC50值及SI.由表1可知：二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物對未感染弓形蟲的HeLa細(xì)胞的IC50高于對照品乙胺嘧啶對未感染弓形蟲的HeLa細(xì)胞的IC50(275.2 μg/mL)，表明二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物對宿主細(xì)胞毒性較??；長白瑞香乙醇提取物及其4個萃取物的SI均高于對照品乙胺嘧啶的SI，表明長白瑞香提取物比乙胺嘧啶具有更好的抗弓形蟲活性.研究[16-19]顯示，香豆素類化合物特殊的構(gòu)效關(guān)系對抗微生物活性的發(fā)揮具有重要意義，同時鐵鰲合劑能有效地抑制宿主細(xì)胞游離的鐵離子數(shù)量，從而有效抑制弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長，因此上述結(jié)果可能與二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中含有作為鐵鰲合劑的香豆素類化合物(瑞香素)有關(guān).

表1不同組別感染弓形蟲前后HeLa細(xì)胞的IC50和SI

4 結(jié)論

利用長白瑞香乙醇提取物對小鼠進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長白瑞香乙醇提取物的LD50值大于10 g/(kg·BW)，對小鼠無毒，因此可對長白瑞香提取物的安全性開展進(jìn)一步地臨床試驗(yàn).長白瑞香提取物在一定程度上可阻止弓形蟲在HeLa細(xì)胞內(nèi)的增殖，抑制其對細(xì)胞的破壞，其中乙酸乙酯和二氯甲烷萃取物的效果較為明顯.長白瑞香提取物對弓形蟲的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究.本文結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)、利用長白瑞香提供科學(xué)依據(jù).