酸脫鈣組織蘇木素-伊紅染色前處理改良方案

姚莉洪 張美 黃美暢 萬(wàn)梓欣 張偉龍 楊肖 楊名仲 陳宇 湯亞玲

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院病理科，成都 610041

口腔頜面部由于解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，送檢標(biāo)本中通常會(huì)含有牙、骨組織、骨腫瘤及鈣化病灶，因此，在病理制片前需用脫鈣劑去除骨組織中的鈣鹽再進(jìn)行切片。目前，使用較多的脫鈣劑有以硝酸為主的酸性脫鈣劑和以乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）為代表的螯合脫鈣液。EDTA較溫和，染色效果較好，但組織滲透性差，脫鈣耗時(shí)長(zhǎng)，影響其應(yīng)用及推廣[1]。因此，人們開(kāi)始嘗試使用方便、耗時(shí)短的酸類(lèi)脫鈣劑，其中硝酸是病理工作中使用最廣的酸類(lèi)脫鈣劑[2]。硝酸脫鈣迅速，得到臨床醫(yī)生認(rèn)可。但硝酸是強(qiáng)酸，對(duì)組織有酸化作用，致使常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后胞漿著色濃、胞核著色淺，組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)模糊，切片效果差。本研究旨在探究牙、骨等硬組織酸脫鈣標(biāo)本HE染色前處理方法，改善硬組織因酸脫鈣后pH變化而引起的切片質(zhì)量欠佳及HE染色組織結(jié)構(gòu)不清的現(xiàn)象。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

隨機(jī)選取2015年1—6月四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院病理科手術(shù)送檢的口腔頜面部來(lái)源的含硬組織標(biāo)本20例。

1.2 處理方法

10%硝酸脫鈣液對(duì)硬組織標(biāo)本進(jìn)行脫鈣，脫鈣完成判斷標(biāo)準(zhǔn)如下。1）物理方法：用手觸及標(biāo)本柔軟、不刺手或大頭針無(wú)阻力刺入組織標(biāo)本[3]。2）化學(xué)方法：5%氫氧化銨儲(chǔ)存液和5%草酸銨儲(chǔ)存液配制檢測(cè)工作液，與脫鈣液混合，若無(wú)沉淀則脫鈣完全。3）射線法：X線看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)[4]。

脫鈣后根據(jù)以下3種處理方式分組觀察。1）常規(guī)處理組：酸脫鈣后將樣本經(jīng)流水沖洗3 h以上。2）濃氨水處理組：酸脫鈣后將樣本經(jīng)流水沖洗30 min以上，25%濃氨水浸泡1～2 h。3）飽和碳酸鋰處理組：酸脫鈣后將樣本經(jīng)流水沖洗30 min以上，飽和碳酸鋰溶液（100 mL雙蒸水+1.5 g碳酸鋰）浸泡1～2 h。

1.3 染色切片質(zhì)量評(píng)判

1.3.1 切片質(zhì)量評(píng)價(jià) 組織切片外觀完整，無(wú)脫片、卷片，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)掉片缺損，對(duì)后續(xù)透明封片工作無(wú)影響，判定為良好，否則視為欠佳。

1.3.2 HE染色評(píng)價(jià) 細(xì)胞形態(tài)完好，胞核、胞質(zhì)著色明顯，核仁清晰，胞漿染色鮮艷，判定為良好，否則視為欠佳。

1.3.3 制片效果滿(mǎn)意度 每一例標(biāo)本均由3位病理醫(yī)師評(píng)閱，其中2位或3位病理醫(yī)師滿(mǎn)意則記為良好，否則記為欠佳。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3組HE染色圖見(jiàn)圖1、2。

圖1 典型圖例1 HE染色Fig 1 Typical picture 1 HE staining

圖2 典型圖例2 HE染色Fig 2 Typical picture 2 HE staining

與常規(guī)處理組（圖1上、圖2上）相比，飽和碳酸鋰處理組（圖1中、圖2中）在切片質(zhì)量、HE染色效果方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)為：HE染色著色強(qiáng)，胞核染色清晰，核仁明顯；胞漿染色鮮艷；切片完整，無(wú)明顯脫片、卷片，對(duì)后續(xù)透明封片工作無(wú)影響，病理醫(yī)師對(duì)切片滿(mǎn)意度高（P＜0.05）（表1）。濃氨水處理組（圖1下、圖2下）在切片質(zhì)量、HE染色效果及病理醫(yī)師滿(mǎn)意度方面優(yōu)勢(shì)均不明顯，鏡下組織結(jié)構(gòu)層次不清晰，HE著色較弱，胞核清晰度欠佳，胞核與胞漿對(duì)比度差。

表1 脫鈣后3種處理方法切片的質(zhì)量、HE染色效果及醫(yī)師滿(mǎn)意度比較Tab 1 Comparison of section quality, HE staining effect and physician satisfaction after decalcification with three methods

3 討論

針對(duì)硝酸脫鈣造成組織“過(guò)酸”這一弊端，本實(shí)驗(yàn)在硝酸脫鈣后通過(guò)濃氨水或飽和碳酸鋰溶液處理標(biāo)本，以期緩解組織“過(guò)酸”，提高切片質(zhì)量。結(jié)果顯示：與常規(guī)方法相比，硝酸脫鈣后經(jīng)濃氨水或飽和碳酸鋰溶液處理后組織切片質(zhì)量及HE染色效果更具有優(yōu)勢(shì)，盡管濃氨水與常規(guī)處理相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其可能機(jī)制為：氨水和飽和碳酸鋰溶液為堿性溶液，可滲透到硝酸脫鈣后的組織細(xì)胞內(nèi)并除酸或使酸中和，使組織切片對(duì)蘇木素嗜染性更強(qiáng)、更穩(wěn)定，從而提高了蘇木素著色能力，減少伊紅過(guò)著色，胞核與胞質(zhì)對(duì)比度好。另外，氨水和飽和碳酸鋰溶液處理經(jīng)硝酸脫鈣的標(biāo)本，縮短了傳統(tǒng)方法硝酸脫鈣后流水沖洗標(biāo)本時(shí)間、操作方便，便于實(shí)施及推廣[5-6]。但濃氨水處理硝酸脫鈣后標(biāo)本，切片質(zhì)量及HE染色效果均不及飽和碳酸鋰溶液，此現(xiàn)象是否與濃氨水作用時(shí)間不足或濃氨水作用緩慢等因素有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。