microRNA-155對重癥急性胰腺炎大鼠急性肺損傷作用的研究

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院急診外科，安徽 蚌埠 233000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)目前仍缺乏有效的特異性的治療方法，治療棘手，仍是死亡率高的疾病[1]。肺臟是重癥急性胰腺炎最先受累的胰外器官，急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是重癥急性胰腺炎嚴重并發(fā)癥之一，當合并有多臟器功能障礙時死亡率可達54%。microRNA-155(miRNA-155)是一類非編碼RNA分子，與靶基因mRNA的堿基配對結合，在免疫調控中發(fā)揮重要作用[2]，同時參與調控炎癥因子，維持細胞生物學穩(wěn)態(tài)。用miRNA-155抑制劑在大鼠中進行試驗以明確是否能夠通過阻斷miRNA-155而減輕重癥急性胰腺炎急性肺損傷的研究少見報道。我們通過建立SAP-ALI大鼠動物模型，觀察重癥急性胰腺炎時miRNA-155抑制組大鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)蛋白、細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)蛋白的表達水平及肺組織病理和TNF-α等炎癥因子變化，探討miRNA-155及其抑制劑siRNA對重癥急性胰腺炎大鼠急性肺臟損傷的影響，為探索重癥急性胰腺炎急性肺損傷相關機制提供新依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠27只，體重186～230 g，隨機均分為：對照組(B1組)、重癥急性胰腺炎組(B2組)和miRNA-155抑制組(B3組)，每組各9只。

1.2 重癥急性胰腺炎動物模型復制和處理 所有雄性清潔級SD大鼠術前均禁食12 h，可以飲水，手術部位備皮。采用異氟烷(上海雅培制藥有限公司提供)吸入性麻醉對SD大鼠進行麻醉，碘伏常規(guī)消毒鋪無菌巾，在無菌條件下行腹正中切口進腹。B1組SD大鼠進腹后僅僅翻動胰腺、十二指腸后隨即縫合切口；B2組SD大鼠采取5%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g)經膽胰管逆行緩慢勻速注入(0.1 ml/min)制作大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷動物模型；B3組大鼠在制作大鼠動物模型前24 h經尾靜脈注射miRNA-155抑制劑siRNA (80 mg/kg，上海吉瑪制藥有限公司)。

1.3 標本采集與檢測方法 分別于制作模型成功12 h后處死所有SD大鼠，經腹主動脈采血備用，一部分肺組織經液氮置入-80℃冰箱冷凍保存，用于檢測肺組織TNF-α蛋白以及ICAM-I蛋白表達情況，另取一部分肺組織用于病理學檢查。

1.3.1 各組SD大鼠血清淀粉酶水平測定 采用全自動生化分析儀測定各組SD大鼠血清淀粉酶水平。

1.3.2 各組SD大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的檢測 ELISA法測定各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3.3 各組SD大鼠肺組織病理學檢查 ①測定各組大鼠肺組織ICAM-1蛋白和TNF-α蛋白表達情況(Western blot法)。②病理學檢查：各組大鼠肺組織標本以10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察，并按Schmidt等[3]對3組肺組織進行病理學評分。

2 結果

2.1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、淀粉酶水平和肺W/D比較 B2組、B3組IL-1β、IL-6、TNF-α、淀粉酶水平和肺W/D水平均高于B1組(P<0.01)，而B2組高于B3組(P<0.01)，見表1。

2.2 各組大鼠肺組織ICAM-1蛋白和TNF-α蛋白表達情況 B1組、B2組、B3組肺組織ICAM-1蛋白和TNF-α蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，B2組、B3組較B1組升高(P<0.01)，B3組較B2組降低(P<0.01)。見表2和圖1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、淀粉酶水平和肺W/D比較

表2 各組大鼠TNF-α蛋白、ICAM-1蛋白表達情況

注：與B1組比較，a：P<0.01；與B2組比較，b：P<0.01

2.3 各組大鼠肺組織病理學變化 B2、B3組肺組織間質炎癥細胞的浸潤及纖維化，肺組織損傷較B1組重；B3組肺組織損傷較B2組減輕。見圖2。 肺組織病理評分：B1組為(0.39±0.13)分，B2組為(7.98±1.26)分，B3組為(6.44±1.15)分；B1組、B2組、B3組肺組織病理評分比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，B3組與B2組比較，B3組降低，B2組與B1組比較，B2組升高。

B1組 B2組 B3組

圖2 光鏡下各組大鼠肺組織病理學改變(HE ×400)

3 討論

至今對重癥急性胰腺炎發(fā)病機制尚不完全清楚，其臨床療效我們一直在不斷的探索[4]。重癥急性胰腺炎時會釋放大量的炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等在重癥急性胰腺炎病程進展過程中發(fā)揮關鍵的作用，所引起的SIRS、多器官功能障礙綜合征(MODS)是其死亡的重要因素。

TNF-α是重癥急性胰腺炎病程中最早產生并起至關重要作用的炎癥因子，在短期內快速升高，并誘導IL-1β、IL-6等細胞因子的產生，作用于血管內皮細胞，導致細胞出血、壞死、蛋白酶激活等。TNF-α可作為啟動因子產生瀑布樣級聯放大效應，促使血小板活化因子、緩激肽、一氧化氮、氧自由基、IL-6等釋放，這些強效介質相互影響形成高度偶聯復雜的網絡系統(tǒng)，這種失控性的級聯效應在重癥急性胰腺炎急性肺損傷中起重要作用，可導致肺組織細胞結構、功能的改變及細胞壞死、SIRS、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、MOF等。在炎癥反應和組織損傷過程中TNF-α擔當重要角色[5]，ICAM-1 的表達受TNF-α調控，ICAM-1可與粒細胞的整合素相互作用，導致細胞損害，由肺組織炎癥感染導致的ARDS病死率可達50%。研究發(fā)現淋巴細胞蛋白激酶R樣內質網激酶表達水平的增加與重癥急性胰腺炎大鼠淋巴細胞的凋亡相關，對重癥急性胰腺炎淋巴細胞凋亡的起調節(jié)作用[6]。我們研究發(fā)現胸腺素α1對重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷具有一定的保護作用[7]，因此，在重癥急性胰腺炎急性肺損傷的治療過程中逐漸重視抑制或降低炎癥因子產生。對重癥急性胰腺炎合并膿毒癥病人采用參附注射液治療可以減輕病人IL-10的過度表達，有較好的臨床療效[8]。

本項研究中B2組復制重癥急性胰腺炎大鼠動物模型成功12 h后血清淀粉酶、IL-1β、IL-6、TNF-α較B1組和B3組明顯升高，炎癥因子大量釋放并遷移至肺組織，對肺毛細血管以及肺泡上皮造成嚴重損傷，肺不張、肺水腫等，最終可導致ARDS、MOF等；同時由于中性粒細胞的活化，產生過多的活性氧等，導致肺組織和細胞的損害，加重肺損傷。本研究也發(fā)現B2組肺組織TNF-α蛋白、ICAM-1蛋白含量、病理評分較B1、B3組顯著升高，病理學檢查發(fā)現肺組織損傷重。

miRNA-155在炎癥反應中扮演重要的角色[9-10]，它參與多種病理炎癥反應[11-12]，與維持細胞生物學穩(wěn)態(tài)，調控免疫與炎癥介質緊密相關[13-14]。研究發(fā)現miRNA-155參與腦缺血/再灌注損傷，在大腦皮層中miRNA-155表達增加[15]，抑制miRNA-155可以改變腦缺血后主要細胞因子的表達，影響炎癥反應進展[16-17]。抑制miRNA-155可增加內皮一氧化氮合酶表達和一氧化氮產生從而減少炎癥反應[18]。而miRNA-155抑制劑對重癥急性胰腺炎急性肺損傷影響如何鮮見報道。本項研究通過采用miRNA-155抑制劑siRNA對重癥急性胰腺炎大鼠急性肺損傷進行干預，結果發(fā)現，重癥急性胰腺炎組(B2組)大鼠血清淀粉酶、IL-1β、IL-6、TNF-α、肺組織TNF-α蛋白、ICAM-1蛋白水平至復制模型成功后12 h明顯升高，肺組織可見炎癥細胞浸潤、組織水腫等。使用miRNA-155抑制劑siRNA后干預組(B3組)大鼠血清淀粉酶、IL-1β、IL-6、TNF-α、肺組織TNF-α蛋白、ICAM-1蛋白、病理評分較B2組顯著降低，肺組織損害較B2組減輕，說明miRNA-155抑制劑siRNA能夠減少重癥急性胰腺炎急性肺損傷大鼠炎癥因子產生，能夠減輕重癥急性胰腺炎肺組織炎癥反應，具有保護作用。本項研究通過血清學檢查、蛋白水平分析miRNA-155抑制劑siRNA對重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的影響，ICAM-1及 TNF-α等炎癥介質的下調，肺組織損傷減輕。重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷是多種炎癥介質共同參與復雜的動態(tài)過程[19]，因此，盡早、有效地抑制這些炎癥介質產生將有助于肺損傷的控制，其確切的作用機制尚需進一步研究。