姜黃素-聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子的制備及對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響

單秋杰，詹小蘭，李玉

(浙江省榮軍醫(yī)院藥劑科，嘉興 314000)

近年來(lái)，納米材料應(yīng)用于癌癥治療取得了顯著進(jìn)展[1-2]。肺癌是我國(guó)癌性死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和病死率也已經(jīng)躍居各種惡性腫瘤首位[3]。研究報(bào)道已有多種天然產(chǎn)物用于治療癌癥，其中姜黃素(curcumin，Cur)可預(yù)防膀胱癌、軟腭癌、胃腸道癌、子宮頸癌、肺癌和皮膚癌等的癌前病變，并已證實(shí)其與惡性腫瘤的治療反應(yīng)有關(guān)[4]。然而，由于姜黃素的低水溶性和低生物利用度等缺點(diǎn)導(dǎo)致其療效并不理想[5]。為了提高姜黃素的治療和預(yù)防作用，設(shè)計(jì)先進(jìn)的藥物輸送系統(tǒng)，如納米載體輸送，具有疏水核心及親水外殼的納米載體有助于疏水藥物的溶解和安全制備[6]。研究表明納米粒子(nanoparticles，NPs)在不同類型的腫瘤治療中發(fā)揮作用[5，7]。在不同類型的疏水性聚合物中，具有生物相容性的聚甲基丙烯酸甲酯(poly methyl methacrylate，PMMA)由于其耐化學(xué)水解、非手性、藥物高滲透性和無(wú)毒性等而被廣泛應(yīng)用于藥物遞送[8]。本研究采用微乳液聚合法制備PMMA NPs，并用生物粘附聚合物聚丙烯酸(poly acrylic acid，PAA)對(duì)Cur-PMMA NPs的表面進(jìn)行功能化，評(píng)估功能化Cur-PMMA NPs對(duì)肺癌A549細(xì)胞的藥物攝取和細(xì)胞活性。

1 材料與方法

1.1材料 PMMA(P141444)、PAA(P131657)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS，S108347)、2，2′-偶氮二異丁腈(2，2′-azo diisobutyronitrile，AIBN，A104255)和姜黃素(C110685)購(gòu)自阿拉??；噻唑藍(lán)(tertrazolium blue，MTT)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(C0009)；人肺腺癌A549細(xì)胞系購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2姜黃素-PMMA NPs的制備及功能化 PMMA NPs采用微乳液聚合法制備，NPs 在恒定攪拌和70 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下進(jìn)料，將AIBN 26.6 mg和SDS7.766 mg混合加入含超純水20 mL的三頸圓底燒瓶中，逐滴加入PMMA，并保持上述反應(yīng)參數(shù)過(guò)夜進(jìn)行聚合過(guò)程，生成NPs。用N，N-二甲基甲酰胺為溶劑配制濃度為1.0 mmol·L-1的姜黃素溶液，將PMMA NPs用超純水稀釋10倍，取2 mL置于透析膜中，逐漸加入姜黃素，直到膜袋外測(cè)得姜黃素。從420 nm波長(zhǎng)的紫外-可見(jiàn)光吸收峰中估算出姜黃素的含量，用于確定載藥率和包封率，公式如下：

NPs中姜黃素的Wt=加入總姜黃素的Wt-游離姜黃素的Wt

輕微攪拌NPs，添加0.01%PAA來(lái)對(duì)姜黃素 NPs進(jìn)行表面功能化，并在25 ℃下保持4 h。

1.3特性檢測(cè) 采用電位分析儀ZS90(Malvern儀器有限公司，Malvern，英國(guó))，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM，德國(guó)Zeiss，Oberkochen)，透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)和傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR；RX1，珀金埃爾默股份有限公司)對(duì)PMMA NPs、Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)。

為了比較Cur-PMMA-NP在不同介質(zhì)中的體外釋放率，在falcon試管中，將Cur-PMMA-NP 1.5 mL分別添加到1.5 mL PBS(pH值 7.4)、0.9%氯化鈉溶液和胎牛血清中，并在37 ℃下孵化10 d，對(duì)藥物釋放情況進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)設(shè)定時(shí)間點(diǎn)，將樣品以3000 r·min-1離心，棄去上清液，將姜黃素溶于乙醇3 mL中，記錄420 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

為了判斷A549細(xì)胞系的藥物攝取，將5組細(xì)胞(對(duì)照組、PMMA- NPs組、游離姜黃素組、Cur-PMMA NPs組和PAA-Cur-PMMA NPs組)置于6孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片上，并在37 ℃下孵育培養(yǎng)到一定密度，然后將它們暴露于50 μg·mL-1的尼羅紅標(biāo)記的PMMA NPs下，用熒光顯微鏡觀察尼羅紅標(biāo)記的PMMA- NPs和PAA-PMMA NPs。

1.4體外抑制腫瘤細(xì)胞 MTT法檢測(cè)姜黃素，PMMA NPs，Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs對(duì)A549細(xì)胞活性的影響。將每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中，并用12.5，25，50和100 μg·mL-1濃度的姜黃素和含等劑量姜黃素的Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs進(jìn)行處理。在24，48和72 h時(shí)，估算與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比的細(xì)胞抑制率。

2 結(jié)果

2.1NPs表征 通過(guò)DLS證實(shí)，PMMA NPs和Cur-PMMA NPs的粒徑為(192.66±5.00)和(199.16±9.00) nm，且沒(méi)有發(fā)生聚集。PAA-Cur-PMMA NPs的粒徑為(205±7.00) nm，PMMA NPs中姜黃素的相應(yīng)載藥率和包封率分別為6.0%和93.0%。與姜黃素相反，由于聚合粒子的包封率很高，姜黃素 NPs產(chǎn)生了高溶解度。根據(jù)Cur-PMMA NPs的SEM圖像和PMMA NPs，Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs的TEM圖像，可以看出粒子呈球形并且具有與DLS數(shù)據(jù)相似的粒徑，在PAA涂層后可見(jiàn)模糊涂層(圖1)。

2.2NPs藥物釋放PMMA NPs在PBS、0.9%氯化鈉溶液和血清中的藥物釋放情況見(jiàn)圖2。在PBS(40%)和0.9%氯化鈉溶液(20%)條件下，姜黃素在5 h內(nèi)爆發(fā)釋放，隨后釋放平緩，在185 h內(nèi)釋放達(dá)83.0%。在血清中觀察到高持續(xù)和控制釋放，其中在150 h內(nèi)釋放40%，240 h內(nèi)釋放75.0%。

2.3細(xì)胞攝取 與游離尼羅紅染料組相比，尼羅紅標(biāo)記的NP樣品內(nèi)化迅速(圖3)。30 min內(nèi)，Cur-PMMA NPs和PAA-Cur-PMMA NPs處理的細(xì)胞內(nèi)可觀察到明亮的熒光，游離姜黃素與之相比，可見(jiàn)非常低的熒光，NPs對(duì)照細(xì)胞未顯示熒光。

2.4體外抗癌活性 對(duì)PAA-Cur-PMMA NPs、Cur-PMMA NPs、游離姜黃素和NPs的體外抗癌活性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，在24 h，游離姜黃素的細(xì)胞活性半數(shù)抑制率濃度(IC50)>100 μg·mL-1，而Cur-PMMA NPs的IC50濃度<12.5 μg·mL-1。在一定時(shí)間內(nèi)(72 h)，Cur-PMMA NPs細(xì)胞抑制具有劑量和時(shí)間依賴性，且顯著高于游離姜黃素。24 h內(nèi)，PAA-Cur-PMMA NPs表現(xiàn)出最大限度的細(xì)胞抑制，且在超過(guò)24 h細(xì)胞完全抑制(圖4，5)。

圖1 NPs的表征

圖2 NPs在PBS、0.9%氯化鈉溶液和血清中姜黃素的釋放曲線

Fig.2ReleaseprofileofcurcumininPBS，0.9%chloridesodiumsolutionorserum

3 討論

姜黃素是一種對(duì)肺癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抗癌活性的植物化學(xué)成分，且無(wú)明顯毒副作用，已有報(bào)道姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抗腫瘤活性[3，9]。姜黃素與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是預(yù)防和治療腫

瘤研究的熱點(diǎn)之一，在臨床化療中具有抗癌，逆轉(zhuǎn)耐藥及減毒多重作用，有助于提高化療療效。但由于姜黃素穩(wěn)定性和溶解性低，限制了其臨床應(yīng)用[5]。納米藥物制劑技術(shù)解決姜黃素的穩(wěn)定性和溶解性低的問(wèn)題，對(duì)于姜黃素的應(yīng)用意義明顯。為此，利用藥物輸送系統(tǒng)，提高姜黃素的穩(wěn)定性和生物利用度，降低藥物的毒性，筆者使用PMMA納米粒子來(lái)包載姜黃素。為進(jìn)一步增強(qiáng)和延長(zhǎng)藥物作用，采用PAA對(duì)NPs的表面進(jìn)行了功能化處理，以保證NPs在病灶的停留時(shí)間更長(zhǎng)。通過(guò)DLS證實(shí)，成功制備了Cur-PMMA NPs，該粒子大小均勻，呈球形，無(wú)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，在PAA涂層后可見(jiàn)模糊涂層。本研究中，PMMA NPs表現(xiàn)出較高的載藥率和包封率，說(shuō)明PMMA與姜黃素分子具有良好的親和力。

圖3 NPs細(xì)胞攝取熒光圖像

圖4 5組A549細(xì)胞對(duì)NPs的攝取效果

圖5 4組A549細(xì)胞在不同時(shí)間內(nèi)的活性比較

由于制劑在體內(nèi)施用后到達(dá)癌細(xì)胞所需的時(shí)間，藥物的持續(xù)釋放將比快速釋放的制劑更有利[10]。姜黃素是一種不穩(wěn)定的化合物，在體內(nèi)藥物生物利用度低下。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cur-PMMA納米粒在血清中的緩釋效果較好，使得血清中姜黃素的持續(xù)釋放可以使藥物在要求的位點(diǎn)持續(xù)可用。

此外，本研究通過(guò)熒光顯微鏡觀察包載尼羅紅熒光染料的NPs的細(xì)胞攝取情況，證實(shí)了Cur-PMMA NPs具有更高的細(xì)胞攝取行為，Cur-PMMA NPs的攝取可確保細(xì)胞內(nèi)的釋放，具有良好的靶向作用，從而使腫瘤細(xì)胞快速有效地死亡。細(xì)胞活性檢測(cè)也顯示，Cur-PMMA NPs的抑制細(xì)胞活性比姜黃素更好。本研究顯示，納米技術(shù)適合有效的局部藥物控制釋放，是提高難溶性藥物療效的一種有效途徑，有助于其在癌癥治療中的應(yīng)用。