巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠情感障礙的作用及其機(jī)制*

肖敏，郭蓮軍，羅攀

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430014；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030)

慢性腦缺血往往會導(dǎo)致不可逆性腦損傷，引發(fā)一系列病理性改變。然而，缺血后情感障礙常常被人們忽略。研究表明，急性或慢性腦血管病中約40%患者會出現(xiàn)情感障礙，包括抑郁癥狀及焦慮癥狀[1-2]。情感障礙的產(chǎn)生能延緩疾病的康復(fù)，導(dǎo)致高致殘率和致死率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究顯示，部分經(jīng)典抗抑郁藥并不適合缺血后治療[3]，所以尋求有效的藥物對缺血后情感障礙進(jìn)行干預(yù)十分必要。

巴氯芬是一種γ-氨基丁酸亞型B(gamma-amino butyric acid type B，GABAB)受體激動藥，臨床上主要用作一些腦部或脊髓疾病繼發(fā)的肌肉痙攣或強(qiáng)直的肌肉松弛藥。近年來，隨著研究的深入，巴氯芬在多種病理狀況下顯示出較好的治療潛力[4-5]。有研究指出巴氯芬對抑郁和焦慮癥狀也具有一定的改善作用[6-7]。然而，巴氯芬能否改善慢性腦缺血所致的情感障礙，以及其所涉及的分子機(jī)制，目前尚未研究清楚。

本研究通過雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(two-vessel occlusion，2VO)建立大鼠慢性腦缺血模型，評價巴氯芬對缺血后大鼠焦慮樣癥狀及抑郁樣癥狀的改善作用。杏仁核是負(fù)責(zé)情感加工最重要的一個腦區(qū)。有研究指出2VO 造模后可導(dǎo)致杏仁核局部腦血流量降低及神經(jīng)元損傷[8-9]。所以本研究進(jìn)一步基于杏仁核探討其作用的分子機(jī)制，并在細(xì)胞模型上進(jìn)行論證。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 巴氯芬(上海邁瑞爾化工科技有限公司，批號：1134-47-0)，腦源性神經(jīng)因子(brain-derived nerve factor，BDNF)抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號：sc-20981)，TrkB抗體(ABclonal Technology，批號：A2099)，GAPDH(CWbiotech，批號：CW010)，BDNF酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(CSB-E04504r-1，Cusabio)，凝膠電泳儀(DYY-8C，北京六一儀器廠)，酶標(biāo)儀(Elx800，Bio2tek)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco，批號：10099-141)，伊格爾改良培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，Hyclone，批號：SH30022.01)。其余試劑均為市售分析純。

1.2實驗動物、細(xì)胞及分組 實驗操作過程均遵循國際衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)關(guān)于動物使用倫理學(xué)方面的原則。清潔級 SD大鼠，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂) 2010-0009，體質(zhì)量約200 g，隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。環(huán)境溫度保持在23～25 ℃，光照遵循自然節(jié)律。通過簡單隨機(jī)化分組，分為假手術(shù)組(n=12)，2VO缺血組(n=16)，2VO+巴氯芬組(n=16)，假手術(shù)+巴氯芬組(n=12)。巴氯芬給藥劑量為25 mg·kg-1(溶于0.9% 氯化鈉溶液中)，腹腔注射，持續(xù)給藥3周，參考文獻(xiàn)[10]，實驗流程見圖1。

實驗用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購自美國菌種保藏中心。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃含5% 二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中養(yǎng)。實驗分為正常對照組，氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型對照組，OGD+巴氯芬小劑量組(50 μmol·L-1)，OGD+巴氯芬中劑量組(100 μmol·L-1)，OGD+巴氯芬大劑量組(200 μmol·L-1)。

1.3大鼠2VO手術(shù)與細(xì)胞OGD模型 大鼠麻醉后將體溫維持在36～38 °C，將兩側(cè)頸總動脈與迷走神經(jīng)分離。之后對雙側(cè)頸總動脈進(jìn)行雙結(jié)扎，并在兩個結(jié)扎點之間剪斷。假手術(shù)組大鼠只分離頸總動脈，不結(jié)扎和剪斷血管。SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)過程中將氧氣用氮?dú)馓鎿Q，并用無糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)建立OGD模型。分別OGD 4及8 h。巴氯芬在OGD前5 min與細(xì)胞共孵育。

1.4焦慮樣行為評價

1.4.1曠場實驗 曠場實驗裝置是由一個100 cm×100 cm×40 cm的黑色敞箱組成，該敞箱上方放置一個數(shù)碼攝像頭，并連接到EthoVision分析系統(tǒng)(Noldus信息技術(shù)公司)。大鼠從敞箱中間放入，攝像頭記錄大鼠5 min內(nèi)的活動情況并進(jìn)行分析。以大鼠運(yùn)動總路程評價其自發(fā)活動，大鼠在中心區(qū)域所待時間評價其焦慮癥狀。

1.4.2十字迷宮實驗 高架十字迷宮裝置是由兩個開放臂(50 cm×10 cm)、兩個閉合臂(50 cm×10 cm×30 cm)以及一個中央?yún)^(qū)域(10 cm×10 cm)組成十字形裝置，該裝置離地面50 cm。大鼠從裝置中央?yún)^(qū)域放入，記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)和停留的時間，大鼠活動記錄和分析系統(tǒng)與曠場實驗相同。

1.5抑郁樣行為評價

1.5.1糖水偏好實驗 整個實驗過程分為3個階段：適應(yīng)階段，基準(zhǔn)值檢測階段，以及糖水偏好檢測階段。大鼠在造模前進(jìn)行糖水適應(yīng)及基準(zhǔn)值檢測：將大鼠每日攝取的自來水換成1%蔗糖溶液，適應(yīng)24 h。隨后將大鼠分籠飼養(yǎng)，配對放置兩個外形一樣的分別含1%蔗糖的水瓶和自來水水瓶，檢測期間水瓶位置相互更換一次。記錄72 h內(nèi)每只大鼠分別攝入的糖水量和自來水量。糖水偏好率=[糖水飲用量/(糖水飲用量+自來水飲用量)]×100%。大鼠造模后第33天進(jìn)行糖水偏好檢測，操作同基準(zhǔn)值檢測。檢測24 h內(nèi)大鼠的糖水偏好率。

圖1 實驗流程圖

1.5.2強(qiáng)迫游泳實驗 強(qiáng)迫游泳實驗裝置由一個高60 cm、直徑20 cm的透明有機(jī)玻璃圓桶組成。圓桶注入水，溫度為(25±2) ℃，深度為40 cm。實驗前一天，大鼠放入圓桶中預(yù)適應(yīng)10 min，實驗當(dāng)天大鼠再次放入圓桶中，記錄5 min內(nèi)大鼠的累積不動時間。

1.6Western blotting檢測蛋白含量 分離各組大鼠杏仁核組織，提取總蛋白。取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后，4 ℃孵育一抗(BDNF及TrkB)12 h。第2天清洗后加入相應(yīng)二抗孵育2 h。洗滌后，加入顯影液顯影成像。使用GAPDH抗體進(jìn)行內(nèi)參校正。曝光圖像用Image J軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.7ELISA分析 收集OGD后各組細(xì)胞上清液，按照BDNF ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。96孔板中每孔加入待測樣本100 μL，然后依次加入一抗工作液(50 μL，120 min)，酶標(biāo)抗體工作液(100 μL，60 min)，底物工作液(100 μL，10 min，避光)。加入終止液100 μL后，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測吸光度值。之后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換成各孔BDNF的濃度。每組設(shè)副孔2個，實驗重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠焦慮樣癥狀 結(jié)果見表1。曠場實驗顯示2VO及巴氯芬不影響大鼠的運(yùn)動總路程，提示其自發(fā)活動不受影響。然而單因素方差分析結(jié)果顯示大鼠在中央?yún)^(qū)域所待時間組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.65，P<0.01)。2VO后大鼠在中央?yún)^(qū)域所待時間明顯縮短(與假手術(shù)組比較，P<0.05)，給予巴氯芬后能延長2VO所致的中央?yún)^(qū)域所待時間(與2VO模型對照組比較，P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果顯示高架十字迷宮實驗中大鼠在開放臂所待時間組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.66，P<0.05)。與假手術(shù)組比較，2VO后大鼠在開放臂所待時間明顯縮短(P<0.05)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬后大鼠在開放臂所待時間顯著延長(P<0.05)。提示巴氯芬能改善慢性腦缺血所致的焦慮樣癥狀。

表1 4組大鼠焦慮樣行為評價結(jié)果

組別大鼠/只曠場實驗運(yùn)動總路程/cm中央?yún)^(qū)域所待時間/s高架十字迷宮實驗開放臂所待時間/s假手術(shù)組121 014.11±79.5322.36±2.4657.15±4.392VO模型對照組161 046.57±68.2915.70±1.83①42.61±3.67①2VO+巴氯芬組16960.36±78.4421.05±1.35②53.88±3.12②假手術(shù)+巴氯芬組12897.63±103.9526.13±2.6049.68±5.04

①與假手術(shù)組比較，t=2.31，2.55，P<0.05；②與2VO模型對照組比較，t=2.02，2.13，P<0.05。

①Compared with sham operation group，t=2.31，2.55，P<0.05；②Compared with 2VO model group，t=2.02，2.13，P<0.05.

2.2巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠抑郁樣癥狀 結(jié)果見表2。在2VO手術(shù)前各組大鼠的糖水偏好率無明顯差異；而2VO手術(shù)后，單因素方差分析結(jié)果顯示糖水偏好率組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.92，P<0.05)。 與假手術(shù)組比較，2VO大鼠糖水偏好率明顯降低(P<0.01)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬干預(yù)2VO大鼠糖水偏好率的下降能得到改善(P<0.05)。同樣，強(qiáng)迫游泳實驗單因素方差分析結(jié)果顯示不動時間組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.69，P<0.05)，與假手術(shù)組比較，2VO后大鼠的累積不動時間顯著延長(P<0.05)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬后能緩解該時間的延長(P<0.05)。提示巴氯芬能改善慢性腦缺血所致的抑郁樣癥狀。

表2 4組大鼠抑郁樣行為評價結(jié)果

組別大鼠/只糖水偏好實驗基準(zhǔn)糖水偏好率/%檢測糖水偏好率/%強(qiáng)迫游泳實驗累積不動時間/s假手術(shù)組1293.76±1.6490.99±2.2028.58±3.632VO模型對照組1693.05±1.3173.17±5.88①45.19±5.12②2VO+巴氯芬組1692.88±1.8186.01±4.01③32.69±3.17③假手術(shù)+巴氯芬組1291.93±1.5984.68±3.8632.17±6.28

①與假手術(shù)組比較，t=2.76，P<0.01；②與假手術(shù)組比較，t=2.51，P<0.05；③與2VO模型對照組比較，t=2.15，2.05，P<0.05。

①Compared with sham operation group，t=2.76，P<0.01；②Compared with sham operation group，t=2.51，P<0.05；③Compared with 2VO model control group，t=2.15，2.05，P<0.05.

2.3巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠杏仁核中BDNF及TrkB蛋白表達(dá)的下調(diào) 慢性腦缺血后大鼠杏仁核中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及受體TrkB的表達(dá)見圖2 。單因素方差分析顯示：BDNF組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.54，P<0.05)，TrkB組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.38，P<0.05)。 與假手術(shù)組比較，2VO手術(shù)后大鼠杏仁核中BDNF及TrkB的表達(dá)顯著下調(diào)(BDNF：t=2.99，P<0.01，TrkB：t=2.44，P<0.05)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬干預(yù)后能緩解杏仁核中BDNF及TrkB的表達(dá)下調(diào)(BDNF：t=2.43，P<0.05，TrkB：t=2.39，P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.2VO模型對照組；C.2VO+巴氯芬組；D.假手術(shù)+巴氯芬組。①與假手術(shù)組比較，t=2.99，P<0.01；②與2VO模型對照組比較，t=2.43，2.39，P<0.05；③與假手術(shù)組比較，t=2.44，P<0.05。

A.Sham group；B.2VO model group；C.2VO+ baclofen group；D.Sham operattion baclofen group；①Compared with sham operattion group，t=2.99，P<0.01；② Compared with the 2VO model group，t=2.43，2.39，P<0.05； ③Compared with sham operattion group，t=2.44，P<0.05.

2.4巴氯芬改善SH-SY5Y細(xì)胞OGD后BDNF分泌的減少 為進(jìn)一步探討巴氯芬對缺血后BDNF的影響，采用ELISA實驗技術(shù)在細(xì)胞水平上檢測了不同劑量巴氯芬對OGD處理后SH-SY5Y細(xì)胞BDNF分泌的影響。結(jié)果見表3。單因素方差分析顯示OGD 4 h組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.10，P<0.05)，OGD 8 h組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.21，P<0.01)。與正常對照組比較，OGD后SH-SY5Y細(xì)胞BDNF的分泌顯著減少(OGD 4 h：P<0.05；OGD 8 h：P<0.01)；與OGD模型對照組比較，給予巴氯芬中、大劑量能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞BDNF分泌減少(P<0.05或P<0.01)。

表3 5組SH-SY5Y細(xì)胞BDNF含量比較

組別OGD 4 hOGD 8 h正常對照組1.00±0.061.00±0.04OGD模型對照組0.82±0.05①0.69±0.02②OGD+巴氯芬 小劑量組0.85±0.020.74±0.03 中劑量組0.96±0.05③0.79±0.02③ 大劑量組1.01±0.03④0.81±0.03③

①與正常對照組比較，t=2.89，P<0.05；②與正常對照組比較，t=6.93，P<0.01；③與OGD模型對照組比較，t=2.31，2.14，2.77，P<0.05；④與OGD模型對照組比較，t=3.10，P<0.01。

①Compared with the normal control group，t=2.89，P<0.05； ② Compared with the normal control group，t=6.93，P<0.01； ③Compared with the OGD model group，t=2.31，2.14，2.77，P<0.05； ④Compared with the OGD model group，t=3.10，P<0.01.

3 討論

近年來，腦缺血后情感障礙的產(chǎn)生越來越引起重視。研究表明改善腦缺血后焦慮或者抑郁癥狀對腦缺血的預(yù)后治療非常重要[11]。所以尋找有效的藥物對腦缺血后情感障礙進(jìn)行干預(yù)十分必要。

曠場實驗和高架十字迷宮實驗是評價動物焦慮樣行為最常用的方法。抑郁樣癥狀最主要的表現(xiàn)特征是快感缺乏和行為絕望，動物實驗中分別常用糖水偏好實驗和強(qiáng)迫游泳實驗評價。通過以上行為學(xué)實驗檢測發(fā)現(xiàn)，巴氯芬能改善慢性腦缺血后大鼠出現(xiàn)的焦慮樣與抑郁樣癥狀。這與之前文獻(xiàn)報道巴氯芬對多種模型的抑郁或焦慮癥狀有改善作用相一致[6-7]。巴氯芬的藥理作用主要與其激活GABAB受體有關(guān)。事實上，其他 GABAB受體的激活劑或變構(gòu)調(diào)節(jié)劑也被報道對抑郁或焦慮癥狀有改善作用[12- 13]。神經(jīng)營養(yǎng)假說是情感障礙發(fā)生最重要的一種假說。研究表明：BDNF可能是連接情感障礙與心腦血管疾病之間的橋梁[14]。而GABAB受體對神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的分泌起重要調(diào)控作用[15]，給予巴氯芬也被證實能促進(jìn)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子包括BDNF的分泌和表達(dá)[16]。這與本研究結(jié)果巴氯芬能上調(diào)缺血后大鼠杏仁核BDNF及其受體TrkB的表達(dá)相對應(yīng)。提示巴氯芬可能通過作用BDNF-TrkB信號通路改善腦缺血后情感障礙的產(chǎn)生。

綜上所述，巴氯芬可改善慢性腦缺血引起的焦慮樣癥狀和抑郁樣癥狀，其機(jī)制可能是通過作用于BDNF-TrkB信號通路而發(fā)揮的。并且巴氯芬作為GABAB受體激動劑有望同時改善腦缺血引起的興奮抑制失衡，使其對腦缺血后的治療更具優(yōu)勢。