五味子乙素對(duì)慢性酒精中毒大鼠海馬組織PSD-95蛋白表達(dá)的影響

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

如今，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的迅猛發(fā)展，人們生活水平在不斷提高，生活方式慢慢改變，社交活動(dòng)變得頻繁，飲酒呈現(xiàn)一種社會(huì)趨勢(shì)，尤其在一些民族地區(qū)更為突出。長(zhǎng)期過(guò)量飲酒，酒精在體內(nèi)大量堆積，可引起慢性酒精中毒。慢性酒精中毒起病隱匿，且病情表現(xiàn)多樣，對(duì)腦損傷尤為嚴(yán)重，可導(dǎo)致記憶力減退、認(rèn)知功能障礙等多種表現(xiàn)，因此，尋找有效解酒藥物和改善慢性酒精中毒導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力障礙的藥物具有重要意義。五味子乙素(Schizandrin B，Sch B)是一類聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，在中藥北五味子中含量最高。目前，Sch B對(duì)大腦、神經(jīng)元的保護(hù)作用及改善學(xué)習(xí)記憶方面的研究已取得了很大成就，但Sch B對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的影響作用方面的研究尚未見相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在探討Sch B對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的影響作用及其相關(guān)機(jī)制，為開發(fā)改善學(xué)習(xí)記憶能力的輔助藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物均為清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011]，采取分籠飼養(yǎng)，飼料供給充足，自由飲水。Sch B購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司，抗體突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)、GAPDH，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)于Proteintech公司，蛋白提取試劑盒購(gòu)于索萊寶科技有限公司，BCA試劑盒、ECL顯色液購(gòu)于碧云天生物制品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及方法 40只健康成年Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5個(gè)組，每組8只大鼠，即為：正常組、模型組、Sch B 低劑量組、Sch B中劑量組和Sch B高劑量組。除正常組每天給予蒸餾水灌胃外，其余四組建立慢性酒精中毒動(dòng)物組，以56°北京紅星二鍋頭白酒灌胃：第一周以8 ml/(kg·d)劑量灌胃，從第二周起，每周增加1 ml，直至增加到10 ml/(kg·d)的劑量，1周后增至12 ml/(kg·d)的灌胃劑量，后按此劑量連續(xù)灌胃至第8周；動(dòng)物模型建立成功后，Sch B低、中、高劑量組分別按10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg給予Sch B灌胃，1 d 1次，連續(xù)灌胃給藥30 d后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物模型建立完成后經(jīng)過(guò)5 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括兩部分實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空間記憶的獲得和參照物記憶能力，過(guò)程為將動(dòng)物先移入實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)1周，實(shí)驗(yàn)第1 d將鼠放入水池中四個(gè)象限分別自由游泳60 s以適應(yīng)環(huán)境，第2 d起將平臺(tái)置于某一象限，進(jìn)行獲得性訓(xùn)練，每日訓(xùn)練4次即4個(gè)不同的象限各一次。實(shí)驗(yàn)時(shí)面向池壁將動(dòng)物放入水中，每次實(shí)驗(yàn)間隔時(shí)間10 s，共訓(xùn)練4 d，動(dòng)物找到平臺(tái)后在平臺(tái)上休息10 s，后繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)象限訓(xùn)練，若規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，則由操作者將其引導(dǎo)上平臺(tái)，在平臺(tái)上休息相同時(shí)間，再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。4 d的定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除水下平臺(tái)，選1個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中，所有動(dòng)物同一入水點(diǎn)，記錄動(dòng)物在60 s內(nèi)第一次跨越平臺(tái)時(shí)間即潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)，電腦采集、描繪軌跡。

1.4 Western Blot免疫印跡 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，冰面上斷頭取出大鼠腦組織，迅速分離海馬組織，取100 mg海馬組織加入1 ml預(yù)冷裂解液，冰上勻漿，后置于冰盒中裂解30 min，將裂解完全后的樣品于冷凍離心機(jī)上10 000～14 000 g離心3～5 min，取上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，配置上樣體系并煮沸使蛋白變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜，二抗室溫振蕩孵育1 h，顯影定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描灰度值，進(jìn)行蛋白半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 Sch B對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從定位航行實(shí)驗(yàn)軌跡采集圖像看出，與正常組相比，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡趨向性較差，多呈邊緣化運(yùn)動(dòng)，偏離平臺(tái)，且在目標(biāo)象限運(yùn)動(dòng)軌跡明顯減少，說(shuō)明慢性酒精中毒導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙，與模型組比較，各Sch B實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)軌跡較少趨向邊緣化，運(yùn)動(dòng)軌跡更多趨向于目標(biāo)平臺(tái)(見圖1)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與正常組比，模型組潛伏期明顯變長(zhǎng)，而平臺(tái)穿越次數(shù)變少(P<0.05)；與模型組比，Sch B低、中劑量組潛伏期逐漸縮短，而平臺(tái)穿越次數(shù)逐漸增多，高劑量組潛伏期明顯縮短(P<0.05)，且平臺(tái)穿越次數(shù)明顯增多(P<0.05)；并且可從運(yùn)動(dòng)軌跡圖看出正常組、Sch B低劑量組、Sch B中劑量組、Sch B高劑量組游泳軌跡探索目標(biāo)方向明確，在目標(biāo)象限探索時(shí)間及路程都較模型組明顯(見表1、圖2)，說(shuō)明Sch B能明顯增強(qiáng)慢性酒精中毒大鼠尋找目標(biāo)平臺(tái)的記憶保持能力。

注：A:正常組；B:模型組；C:Sch B低劑量組；D:Sch B中劑量組；E:Sch B高劑量組

表1 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期和平臺(tái)穿越次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：A:正常組；B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組

2.2 Sch B對(duì)慢性酒精中毒大鼠海馬組織PSD-95蛋白表達(dá)的影響 Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中的PSD-95蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；給予Sch B藥物治療后，與模型組相比，Sch B低劑量組、Sch B中劑量組、Sch B高劑量組海馬組織中的PSD-95蛋白表達(dá)逐漸增高，中、高劑量組PSD-95蛋白表達(dá)水平增高明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A

B

圖3 Western Blot法檢測(cè)各組海馬組織中PSD-95蛋白表達(dá)水平

注： A：Western blot電泳圖；B：PSD-95蛋白相對(duì)表達(dá)量。與正常組比較，*：P<0.05；與模型組比較，#：P<0.05

3 討論

隨著社會(huì)進(jìn)步迅速發(fā)展，人們生活水平越來(lái)越好，同時(shí)社會(huì)的進(jìn)步帶來(lái)了很多挑戰(zhàn)，使得人們壓力越來(lái)越大，應(yīng)酬成為一種常態(tài)，酒精的非正常消耗問(wèn)題日益凸顯，且慢性酒精中毒治療者復(fù)飲率也在不斷提高，造成一系列嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，近年來(lái)，濫用酒精問(wèn)題更加嚴(yán)峻[1-3]。酒精具有很好的水溶性，飲酒后會(huì)迅速被人體胃腸黏膜吸收，隨血液循環(huán)到達(dá)人體的各組織、器官貯存，因此長(zhǎng)期過(guò)量飲酒，酒精在體內(nèi)大量堆積，可引起慢性酒精中毒。同時(shí)酒精具備親脂性小分子特性，其特征驅(qū)使酒精能快速通過(guò)血腦屏障抵達(dá)大腦，作用于腦組織，與神經(jīng)細(xì)胞膜有較高的親和力，并通過(guò)作用于膜上的某些酶類和受體而影響細(xì)胞的功能，進(jìn)而引起學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知、判斷等一系列神經(jīng)行為功能的改變[4-5]。本研究中，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性酒精中毒模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡趨向性較差，多呈邊緣化運(yùn)動(dòng)，偏離平臺(tái)方向，且在平臺(tái)所在目標(biāo)象限運(yùn)動(dòng)軌跡明顯減少，尋找平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)也明顯減少，說(shuō)明長(zhǎng)期過(guò)量飲酒引起慢性酒精中毒將導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙發(fā)生，與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，但酒精中毒引起學(xué)習(xí)記憶障礙具體發(fā)生機(jī)制還沒(méi)有明確。

Sch B是一類聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，在中藥北五味子中含量最高，且為木脂素中的單體化合物成分，Sch B具有改善認(rèn)知功能的作用，主要包括興奮中樞、改善學(xué)習(xí)和記憶功能[7]，有研究表明，Sch B能有效地抑制體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)自發(fā)突觸活動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的興奮性和網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)元的同步性活動(dòng)，抑制胞內(nèi)同步鈣振蕩。且其能通過(guò)調(diào)控蛋白的表達(dá)而抑制阿爾茨海默癥小鼠神經(jīng)元線粒體凋亡，保護(hù)受損神經(jīng)元，改善其學(xué)習(xí)記憶能力[8-9]。實(shí)驗(yàn)中，給予每天灌胃Sch B治療后，大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡較少趨向邊緣化，運(yùn)動(dòng)軌跡更多趨向于目標(biāo)平臺(tái)，潛伏期縮短，跨平臺(tái)次數(shù)增多，說(shuō)明Sch B對(duì)慢性酒精中毒導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用，但其改善作用尚機(jī)制未清楚。

海馬區(qū)的主要功能是參與學(xué)習(xí)記憶，海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷能引起學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知判斷障礙發(fā)生。神經(jīng)系統(tǒng)可塑性改變最敏感的部位在于突觸，其作用為在神經(jīng)元之間傳遞信息和加工信息，人類行為表現(xiàn)記憶過(guò)程和記憶維持都與突觸密切相關(guān)，記憶得以保持的根本取決于突觸數(shù)量的穩(wěn)定，但突觸又不是恒定不變，其數(shù)量及結(jié)構(gòu)可隨體內(nèi)外各種環(huán)境的改變而發(fā)生變化，突觸可塑性影響著學(xué)習(xí)和記憶能力，突觸喪失的結(jié)果可引起神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能異常，從而導(dǎo)致信息傳遞障礙[10-11]。PSD-95是突觸后致密物質(zhì)中興奮突觸后致密物質(zhì)主要的蛋白質(zhì)成分，PSD-95通過(guò)其特有不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)域與其它蛋白相互作用，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，是神經(jīng)信息傳遞的重要基礎(chǔ)，PSD-95 蛋白的組織性質(zhì)和它動(dòng)態(tài)重組的能力是酒精誘導(dǎo)突觸效能改變的主要特征[12-13]。PSD-95是與突觸傳遞緊密相關(guān)的主要蛋白之一，PSD-95表達(dá)水平與突觸可塑性及其生物學(xué)功能密切相關(guān)，其表達(dá)下降說(shuō)明突觸可塑性降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，酒精中毒模型組大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，且其海馬組織中PSD-95 蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)，說(shuō)明PSD-95 蛋白表達(dá)水平降低與慢性酒精中毒導(dǎo)致海馬突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶能力的損傷相關(guān)，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。Sch B低劑量組、中劑量組、高劑量組中，慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙得到改善，大鼠海馬組織中的PSD-95 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，說(shuō)明Sch B可能通過(guò)調(diào)控海馬區(qū)PSD-95 蛋白表達(dá)水平改善慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙。

綜上所述，PSD-95是神經(jīng)信息傳遞的重要基礎(chǔ)，其表達(dá)下降說(shuō)明突觸可塑性降低，引起慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙，Sch B可能通過(guò)調(diào)控海馬區(qū)PSD-95 蛋白表達(dá)水平改善慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這可能是Sch B改善慢性酒精中毒大鼠認(rèn)知能力障礙的機(jī)制之一，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究和探討。