他克莫司促進(jìn)顱腦損傷大鼠誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生的研究

何新澤 林書卿 楊濤 王成剛 李芹 薛惠萍 高麗麗 李玲玲(濱州市中心醫(yī)院 山東 濱州 251700）

臨床上常見到顱腦損傷合并周圍神經(jīng)損傷的患者，神經(jīng)損傷獨(dú)特的病理生理過程，導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)不全，生活質(zhì)量下降[1]。王維、何新澤等通過建立腦損傷模型發(fā)現(xiàn)大鼠在顱腦損傷合并的周圍神經(jīng)損傷，修復(fù)速度加快[2]；大量研究證實(shí)他克莫司促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)再生[3]。他克莫司主要通過免疫抑制、神經(jīng)營養(yǎng)來促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生[4-7]。本實(shí)驗(yàn)通過比較神經(jīng)恢復(fù)情況，探索顱腦損傷促進(jìn)神經(jīng)損傷恢復(fù)的機(jī)制。

1.資料和方法

1.1 造模動物及材料

實(shí)驗(yàn)在2018年10月—2019年02月在濱州市中心醫(yī)院完成。

實(shí)驗(yàn)動物：選用SPF級雄性SD大鼠180只，200～220g（北京維通利華SCXK(京)2012-0001）。飼養(yǎng)條件：晝夜各12 h、溫度23±1℃。將大鼠完全隨機(jī)分為4組，每組45只。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過濱州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，按照國際動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

主要設(shè)備及試劑：手術(shù)顯微鏡（LZL-6A型，鎮(zhèn)江中天公司），光學(xué)顯微鏡（BH-3型，Olympus公司），他克莫司100mg（Selleck)，頭孢唑啉納（魯抗制藥，國藥準(zhǔn)字H19993050）、甲苯胺藍(lán)（Sigma）、BL-420F系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）、熒光金（Sigma），冰凍切片機(jī)（Leica819）。

1.2 造模方法：

1.2.1造模步驟：禁食水4小時，術(shù)區(qū)備皮剪毛。術(shù)前30分鐘，體重100g給予肌肉注射頭孢唑啉鈉10mg，體重100g給予10%水合氯醛按照0.35ml腹腔全麻；A組（顱腦損傷+坐骨神經(jīng)損傷）：碘伏消毒，在頭部正中矢狀切開，顱骨開窗處位于冠狀線后1.5mm、中線偏左5mm，骨窗直徑5mm，撞擊造成中度腦損傷；右側(cè)臀部，顯微鏡下完全切斷坐骨神經(jīng)，9～0無損傷線縫合坐骨神經(jīng)外膜4～6針[8]。B組 （坐骨神經(jīng)損傷）：顯微鏡下完全切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)，縫合坐骨神經(jīng)外膜。

1.2.2造模后的干預(yù)：他克莫司用0.9%氯化鈉稀釋，0.9%氯化鈉他克莫司（1ml：1mg），現(xiàn)用現(xiàn)配制；造模手術(shù)12小時后，A1組大鼠按體重100mg給予他克莫司0.5mg腹腔注射，A兩組給予等量生理鹽水腹腔注射，B1組大鼠按體重100mg給予他克莫司0.5mg腹腔注射，B兩組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。每日應(yīng)用1次，持續(xù)2周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1坐骨神經(jīng)干動作電位恢復(fù)率測定：造模后8周、12周進(jìn)行測定，每組每次隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后，暴露坐骨神經(jīng)，在神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)端0.5cm放置刺激電極1，吻合口近端放置刺激電極2，將記錄到的電信號直接輸入BL-420F系統(tǒng)中。

1.3.2 坐骨神經(jīng)的甲苯胺藍(lán)染色：造模后4周、8周、12周，每組每次隨機(jī)取5只大鼠，橫行切片4um,1%甲苯胺藍(lán)染色20分鐘，快速酒精分色，中性樹膠封片，觀察神經(jīng)纖維的髓鞘再生情況。

1.3.3熒光金示蹤：造模后12周，微量注射器在坐骨神經(jīng)斷端以遠(yuǎn)0.5cm處，注入4%的熒光金溶液5μl，2分鐘后緩慢退針。術(shù)后7天，灌流固定，取坐骨神經(jīng)對應(yīng)脊髓節(jié)段，冰凍切片脊髓橫斷面20μm。熒光顯微鏡下觀察脊髓前角熒光金陽性運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

造模后大鼠基本生活狀態(tài)的觀察：造模后所有動物均存活，切口無感染。造模1周后B兩組大鼠出現(xiàn)足部紅腫明顯，其他組紅腫較輕。造模3周后，A2、B1、B兩組大鼠足跟出現(xiàn)程度不同的潰瘍面，A1組大鼠足部未見明顯潰瘍；造模12周后，各組大鼠足部潰瘍基本痊愈，B兩組大鼠出現(xiàn)足部的自食現(xiàn)象。

2.1 坐骨神經(jīng)干的動作電位幅值恢復(fù)率

造模第8周，各組大鼠坐骨神經(jīng)干的動作電位幅值恢復(fù)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），A1優(yōu)于A2、B1、B兩組、A2優(yōu)于B1、B兩組、B1優(yōu)于B兩組；第12周時，A2與B1組大鼠坐骨神經(jīng)干的動作電位幅值恢復(fù)率接近（P＞0.05），A1優(yōu)于A2、B1、B兩組，A2優(yōu)于B兩組，B1優(yōu)于B兩組(P ＜0.01），見表。

表 腦損傷、FK506對周圍神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)干動作電位恢復(fù)率的影響（±s）

表 腦損傷、FK506對周圍神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)干動作電位恢復(fù)率的影響（±s）

組別8周12周 A182.56±1.6388.37±1.59 A264.21±3.0276.24±3.52 B147.64±2.3575.60±2.53 B245.33±3.0348.60±3.01

腦損傷、FK506對周圍神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)干動作電位恢復(fù)率（%）的影響（實(shí)驗(yàn)條件：屏蔽櫥內(nèi)進(jìn)行，室溫25±0.5℃，刺激強(qiáng)度1.2mv、波寬0.05ms）。

2.2 造模4周后，A1組可見Schwann細(xì)胞形成的神經(jīng)內(nèi)膜管，A2、B1組未形成神經(jīng)內(nèi)膜管，B兩組可見大量單核細(xì)胞核、散在Schwann細(xì)胞核；造模后8周、12周，A1組再生有髓神經(jīng)纖維髓鞘較A2、B1、B兩組厚且規(guī)則，A2、B1組髓鞘厚度無顯著差異，A2、B1組髓鞘較B兩組厚（見圖1）。

圖1. 坐骨神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色（×400）

4周：A1組可見Schwann細(xì)胞形成的神經(jīng)內(nèi)膜管，A2、B1組未形成神經(jīng)內(nèi)膜管，B兩組可見大量單核細(xì)胞核、散在Schwann細(xì)胞核；8周、12周：A1組再生有髓神經(jīng)纖維髓鞘較A2、B1、B兩組厚且規(guī)則，A2、B1組髓鞘厚度無顯著差異，A2、B1組髓鞘較B兩組厚。

2.3熒光金示蹤標(biāo)記：光鏡下，觀察各組相應(yīng)脊髓節(jié)段前角神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中熒光顆粒，（見圖2）。每高倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；造模后第12周，各組脊髓神經(jīng)元胞漿熒光金標(biāo)記陽性率率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A2與B1組大鼠脊髓神經(jīng)元胞漿HRP標(biāo)記陽性率接近（P＞0.01），A1高于A2、B1、B兩組，A2高于B兩組，B1高于B兩組(P＜0.01）。

圖2 術(shù)后12周脊髓前角熒光金陽性神經(jīng)元（×100）

第12周時，A兩組HRP標(biāo)記脊髓前角陽性率77.24±1.52%與B1組大鼠脊髓神經(jīng)元胞漿熒光金標(biāo)記陽性率78.60±2.23%接近（P＞0.01），A1組熒光金標(biāo)記脊髓前角陽性率82.37±1.33%高于A兩組77.24±1.52 %、B1組78.60±2.23%、B兩組42.63±2.12%，A兩組熒光金標(biāo)記脊髓前角陽性率高于B兩組42.63±2.12%，B1組熒光金標(biāo)記陽性率78.60±2.23%高于B兩組42.63±2.12%(P＜0.01）。

3.討論

何新澤等通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠腦損傷后伴隨損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)重建明顯加快，但具體修復(fù)機(jī)制尚不清楚[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過比較顱腦損傷聯(lián)合應(yīng)用他克莫司的坐骨神經(jīng)損傷恢復(fù)情況。在所有的實(shí)驗(yàn)觀測項(xiàng)目中，A1組（顱腦損傷聯(lián)合他克莫司）大鼠的坐骨神經(jīng)修復(fù)效果要優(yōu)于其他組，證實(shí)顱腦損傷可以與他克莫司協(xié)同促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后的修復(fù)，其作用機(jī)制與他克莫司不完全相同。

周圍神經(jīng)SunderlV的損傷，切斷了神經(jīng)內(nèi)分泌的營養(yǎng)支持。神經(jīng)內(nèi)分泌產(chǎn)生的物質(zhì)不能輸送到靶器官上，靶器官將失去活性和營養(yǎng)的支持。目前他克莫司促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)明確是兩個功能領(lǐng)域，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能，形成一個FKBP12的綜合體，加入功能區(qū)域后表達(dá)GAP-43，并促進(jìn)形成和擴(kuò)大神經(jīng)的生長由神經(jīng)脈沖生成的生物電能，再生軸突的內(nèi)徑上升，形成厚厚的神經(jīng)膜層，作用范圍增加[1，3]。這證實(shí)了他克莫司有助于恢復(fù)周圍神經(jīng)的營養(yǎng)功能，坐骨神經(jīng)動作電位恢復(fù)率、神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，提示促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的作用，結(jié)合功能或復(fù)雜的FKBP12 地區(qū)來促進(jìn)表達(dá)GAP-43。

在周圍神經(jīng)損傷后，軸突的退化立即發(fā)生，軸突碎片是由巨噬細(xì)胞吞噬清除的，新的軸突、未退化的神經(jīng)元延伸到由Schwann細(xì)胞組成的內(nèi)膜神經(jīng)的間隙，靶器官逐漸建立聯(lián)系和營養(yǎng)[1-3]。靶器官的恢復(fù)熒光金神經(jīng)顯示，A1組在他克莫司的免疫抑制效果方面優(yōu)于A2/B1/B兩組，他克莫司結(jié)合FKBP12，形成鈣復(fù)合物抑制堿（CAN），抑制T細(xì)胞的衰減，并抑制IL-2、IL3的表達(dá)，以生產(chǎn)免疫抑制物[4-7]被神經(jīng)接收。

周圍神經(jīng)的損傷伴隨著血液神經(jīng)屏障的破壞，刺激纖維增生和巨噬細(xì)胞的擴(kuò)散，形成影響神經(jīng)修復(fù)的疤痕[4-7]。他克莫司可以抑制纖維素的擴(kuò)散、遷移和生物活性，抑制纖維素的擴(kuò)散，并通過免疫抑制作用促進(jìn)神經(jīng)損傷的重建和修復(fù)。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，創(chuàng)造微型環(huán)境的因素、Schwann細(xì)胞的信號有助于促進(jìn)軸突再生[1]。軸突內(nèi)物質(zhì)更好地恢復(fù)運(yùn)輸功能和靶器官的反饋是相互促進(jìn)的[1，5]。熒光金染色證明A1比 A2/B1/B兩組免疫神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在腦損傷期間有密切的關(guān)系[6]，自主神經(jīng)系統(tǒng)的中心結(jié)構(gòu)被摧毀，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)紊亂、改變或喪失，功能腦細(xì)胞的變性，導(dǎo)致caspase瀑布反應(yīng)性的激活，導(dǎo)致神經(jīng)凋亡。

本試驗(yàn)結(jié)果提示大鼠顱腦損傷伴隨周圍神經(jīng)損傷動物早期應(yīng)用他克莫司后，周圍神經(jīng)修復(fù)再生方面較好，腦損傷、他克莫司均可促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)，并且協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)效果更好，為腦損傷合并周圍神經(jīng)損傷的患者提供了新的治療思路。但腦損傷促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。