非結(jié)核分枝桿菌菌種如何檢測鑒定

王小芳

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosismycobacteria，NTM）原來被稱之為原稱非典型分枝桿菌（atypicalmycobacteria），是指那些除了結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌以及牛分枝桿菌之外的分枝桿菌。NTM在自然環(huán)境中普遍存在，可以在自然環(huán)境下繁殖并通過空氣傳播。據(jù)相關(guān)報(bào)道，供水系統(tǒng)是NTM感染的最主要渠道。近年來，隨著醫(yī)務(wù)工作者對非結(jié)核分枝桿菌（NTM）疾病認(rèn)識(shí)的提高，臨床發(fā)現(xiàn)越來越多的NTM感染。非結(jié)核分枝桿菌的菌種數(shù)量多，截止2015年年底，已證實(shí)達(dá)到173種。不同菌種所致的感染性疾病，影像學(xué)極其相似，非結(jié)核分枝桿菌感染在癥狀上難于與結(jié)核分枝桿菌感染區(qū)別，但治療方案差異太大，因此把這兩種感染區(qū)分開來，意義重大。故此，關(guān)于非結(jié)核分枝桿菌，準(zhǔn)確鑒定菌種是臨床治療的前提與保障。

常用NTM的菌種鑒定方法

一 傳統(tǒng)方法

1 表型判定：根據(jù)生長速度、菌落形態(tài)及是否產(chǎn)色等特征，鑒別菌種

在營養(yǎng)豐富、溫度適宜的條件下培養(yǎng)，根據(jù)生長時(shí)間的快慢分為快生長菌和慢生長菌。固體培養(yǎng)基上，結(jié)核桿菌生長緩慢，一般需4周時(shí)間方可形成1mm（直徑）左右菌落，菌落致密且干燥，多呈淡黃色或者黃色，表面粗糙，可見皺紋，邊緣不整齊稱為慢生長菌。生長快速、可見特殊顏色且菌落形態(tài)明顯異于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC），考慮存在NTM，可進(jìn)一步鑒定菌種。

2 生化方法：煙酸產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)，熱觸酶穩(wěn)定性、PNB生長實(shí)驗(yàn)等。常用方法為PNB生長實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)原理是利用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌在含有對硝基苯甲酸的羅氏培養(yǎng)基上是否生長的特性。根據(jù)不同的報(bào)道，98%-100%的結(jié)核桿菌復(fù)合群在含PNB的羅氏培養(yǎng)基上不能夠生長，而NTM中除個(gè)別種的分枝桿菌，或個(gè)別種中的少量菌株外，都能耐受，生長良好。

傳統(tǒng)鑒定方法僅根據(jù)細(xì)菌的生長特點(diǎn)和生化反應(yīng)進(jìn)行觀察分析判定NTM具有一定的局限性，但是這一方法在我國卻得到普遍應(yīng)用，就是由于該方法操作簡單，不需要特殊的技術(shù)與設(shè)備，價(jià)格便宜，具有較高的實(shí)用性，故而可達(dá)到推廣的效果。

二 分子技術(shù)

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）

目前，PCR技術(shù)在臨床上應(yīng)用較廣泛，這些PCR技術(shù)擴(kuò)增靶序列主要是MTC中的特異性DNA序列，包括IS6110、MPT64、CEP-10、ESAT-6等。故此，PCR技術(shù)一般需要結(jié)合現(xiàn)有涂片及培養(yǎng)技術(shù)，初步篩查NTM。針對涂片呈陽性或者培養(yǎng)呈陽性的標(biāo)本，平行的PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示陽性，一般提示樣品中有MTC菌，相反的，PCR呈陰性時(shí)考慮存在NTM，不過仍需進(jìn)一步證實(shí)。

2 分子診斷技術(shù)

直接同源基因或者序列比較法

對同源DNA序列組成差異進(jìn)行分析，鑒定細(xì)菌菌種，這種方法是現(xiàn)目前鑒別菌種的一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”?，F(xiàn)在比較常用的RNA聚合酶的β亞基（ropB）、熱休克蛋白65（hsp65）編碼基因、16S-23SrRNA基因間區(qū)（ITS）、16SRNA編碼基因（16SDNA）等，都屬于同源序列。若是單單看鑒別能力，hsp65比ropB及ITS更好，而16SDNA最低。

間接同源基因或者序列比較法

同源基因或者序列測定法，雖然鑒別能力強(qiáng)大，但是，因?yàn)榧夹g(shù)操作難度大，且需要昂貴設(shè)備，難以大范圍推廣應(yīng)用。故此，間接序列比較法引起了人們的關(guān)注與重視。根據(jù)特定同源基因或者序列（包括ITS及16sDNA等）特定單核苷酸多態(tài)性，設(shè)計(jì)的位點(diǎn)探針，現(xiàn)目前已經(jīng)商用，固相基質(zhì)上面標(biāo)記探針，根據(jù)探針和待檢測序列之間的結(jié)合情況，對DNA序列組成進(jìn)行間接判斷，鑒別菌種。一般來說，選擇單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，主要依據(jù)可鑒別NTM的位點(diǎn)。

第一，線性探針雜交技術(shù)。這個(gè)技術(shù)主要目的在于對樣本中的核苷酸序列進(jìn)行判斷，輔助觀察非結(jié)核分枝桿菌的雜交情況，判斷非結(jié)核分枝桿菌的菌種。德國HAIN生命科學(xué)公司已經(jīng)研發(fā)多款，一次性雜交，便可鑒別MTC與NTM，且可進(jìn)一步鑒別NTM的菌種。

第二，DNA芯片技術(shù)。基因芯片，也稱NDA或者是cDNA微陣列，指約1cm的載體上點(diǎn)布諸多不同寡核酸苷或者是DNA探針，和帶有標(biāo)記的待測DNA或者是mRNA進(jìn)行雜交，根據(jù)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)弱程度，對DNA或者mRNA中和芯片相應(yīng)基因變異或者表達(dá)情況進(jìn)行判斷分析。20世紀(jì)80年代開始應(yīng)用基因芯片技術(shù)，國內(nèi)產(chǎn)品包括博奧生物有限公司生產(chǎn)研發(fā)的芯片，適用于鑒別診斷16種NTM。

第三，基因探針。基因探針，是一種用熒光標(biāo)記出來的單鏈DNA探針，樣品中細(xì)菌能夠釋放出與其互補(bǔ)的rRNA，兩者通過雜交，進(jìn)而產(chǎn)生一種熒光信號(hào)，借助特定的設(shè)備儀器，對熒光情況進(jìn)行檢測分析，輔助結(jié)果判定。這一技術(shù)，操作簡單，一般1個(gè)小時(shí)內(nèi)可完成檢測。

3 根據(jù)細(xì)菌組成成分結(jié)構(gòu)差異，鑒定菌種

較成熟的技術(shù)有分枝菌酸結(jié)構(gòu)分析技術(shù)（高效液相色譜分析儀）與飛行質(zhì)譜檢測法（MOTITOF飛行質(zhì)譜技術(shù)）。細(xì)菌脂質(zhì)及蛋白質(zhì)組成，都具備特異性，可據(jù)此鑒別。兩種方式都適用于陽性培養(yǎng)物，故而臨床及時(shí)診斷中應(yīng)用價(jià)值不高。通過比較發(fā)現(xiàn)，分枝菌酸結(jié)構(gòu)分析技術(shù)的操作過程相當(dāng)復(fù)雜，而且試劑的開放度較窄，費(fèi)用高。飛行質(zhì)譜檢測法這種方法的操作相對簡單一點(diǎn)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，成本也低。但是，需要關(guān)注的一點(diǎn)是，以上談及的兩種方法都存在很大的局限性，都需要昂貴的儀器設(shè)備才能完成檢測，故而在臨床中難以得到普遍推廣。

4 MPB64抗原檢測法

一般來說，可以采取免疫層析法，測定培養(yǎng)濾液中有無MPB64抗原，操作簡單，耗時(shí)短，無需特殊設(shè)備，在初步鑒定MTC與NTM中敏感性高、特異性高。需要關(guān)注的一點(diǎn)是，由于MPB64抗原編碼基因突變，有一些結(jié)核分枝桿菌會(huì)呈現(xiàn)出陰性結(jié)果，具體可能表現(xiàn)出以下情況：有的卡介苗培養(yǎng)時(shí)，沒有分泌出MPB64抗原，故而檢測呈陰性;（2）海分枝桿菌，可分泌微量MPB64抗原，結(jié)果呈弱陽性。MTC與NTM同時(shí)存在的情況，檢測結(jié)果呈陽性，但無法提示存在NTM。

總之，非結(jié)核分枝桿菌菌種的檢測方法較多，實(shí)踐操作中，我們可以根據(jù)具體條件進(jìn)行選擇，提高測定準(zhǔn)確性。